《Nucleic Acids Research》：Genome-wide extraction of differentially methylated DNA regions using adapter-anchored proximity primers
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本研究针对传统甲基化检测方法在覆盖范围、灵敏度和成本效率方面的局限，开发了名为aMAPP的创新PCR富集技术。该技术通过设计特殊邻近引物，结合EM-seq或TAPS转化方法，实现了对CpG岛中高甲基化和低甲基化区域的特异性富集。研究证实aMAPP仅需皮克级DNA输入和超低深度测序（~30万reads）即可检测到0.01%等位基因频率的异常甲基化，在结直肠癌样本中成功鉴定出数百个DMRs。这项技术为癌症液体活检和表观遗传学研究提供了简单、经济且高灵敏度的新策略。
在癌症研究领域，DNA甲基化异常作为重要的表观遗传学标志物日益受到关注。CpG岛（CGIs）作为基因组中富含CpG二核苷酸的区域，虽然仅占人类基因组的1%-2%，却在癌症发生发展中扮演着关键角色。这些区域中的差异甲基化区域（DMRs）能够成为临床样本和液体活检中的理想生物标志物，甚至能够提供组织来源信息，类似于癌症特异性体细胞突变。然而，如何在大量正常DNA背景下高效检测异常甲基化的CGIs，一直是制约其临床应用的瓶颈。
目前主流的全基因组甲基化分析方法，如全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）、酶学甲基转化测序（EM-seq）和TET辅助吡啶硼烷测序（TAPS），虽然能提供单碱基分辨率，但在检测高比例正常DNA中的异常甲基化CGIs时效率低下。而现有的甲基化富集方法，如甲基化免疫共沉淀和甲基化特异性限制性内切酶方法，又存在无法提供单碱基分辨率、操作耗时、成本高等局限。靶向方法虽然灵敏度高，但其基因组覆盖范围有限。甲基化芯片技术虽然覆盖较广，但灵活性不足。这些技术缺陷促使研究人员开发新的甲基化检测策略。
为了解决这些问题，来自国外研究机构的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了一项创新性研究，开发了一种名为"适配器锚定甲基化扩增通过邻近引物"（aMAPPs）的新型PCR富集方法。该技术核心在于特殊设计的邻近引物（PPs），这些引物能够根据所选甲基化转化方法，特异性扩增甲基化或非甲基化的邻近CpG位点。
研究人员主要运用了几项关键技术：首先是通过标准文库制备流程进行DNA末端修复和接头连接；其次是采用EM-seq或TAPS两种甲基化转化方法；最关键的是设计了特殊的邻近引物进行PP-PCR扩增，这些引物包含与接头序列互补的"骨架"和靶向下游CpG位点的"探针"部分；最后通过超低深度测序（约30万reads）进行数据分析。研究使用了NA12878细胞系基因组DNA、商业化的完全甲基化和非甲基化对照DNA，以及5对结直肠癌患者的肿瘤和癌旁正常组织样本，同时还测试了健康志愿者来源的细胞游离DNA（cfDNA）样本。
概念验证
研究人员首先验证了邻近引物（PPs）的工作原理。PPs由"骨架"和"探针"两部分组成，骨架与连接在DNA上的适配器序列互补，而探针（6-12bp）则含有CpG位点，能够与同一DNA链上下游可能存在的互补序列结合。在PP-PCR过程中，骨架先与适配器结合，然后DNA链发生折叠，使得探针的3'端能够与附近的匹配靶序列结合，进而启动引物延伸。实验证明，使用9bp探针（CGACCCGCG）的PP能够高效扩增甲基化的ultramers（模拟转化后甲基化DNA的长寡核苷酸），而当探针靶点位于适配器5-100bp范围内时，对非甲基化ultramers的扩增效率极低，差异达到32,768倍。
aMAPP高效富集甲基化/非甲基化CpG岛
应用aMAPP对甲基化和非甲基化对照DNA进行测试发现，该方法能够选择性富集甲基化或非甲基化CpG，具体取决于所采用的转化方法。在EM-seq转化文库中，aMAPP覆盖的CpG有88.8%表现出超过70%的甲基化水平；而在TAPS转化文库中，96.8%的CpG显示低于20%的甲基化水平。与标准文库相比，aMAPP在甲基化富集方面能够获得比标准EM-seq多36.6倍（覆盖度≥2）和746倍（覆盖度≥5）的CGIs；在非甲基化富集方面，则比标准TAPS多196.4倍（覆盖度≥2）和4353倍（覆盖度≥5）的CGIs。
aMAPP在低DNA输入下的性能和灵活靶向
研究人员测试了aMAPP在不同DNA输入量下的表现，即使在最低0.01ng的cfDNA输入下，仍能成功捕获905个CGIs，其中258个与5ng输入样本检测到的CGIs重叠。通过调整探针序列，aMAPP能够灵活靶向特定癌症类型的高甲基化CGIs，如探针CGAACGCGAA能够捕获结直肠癌中20个最常见高甲基化CGIs的全部。当同时使用3种不同探针的PPs组合时，aMAPP在中等测序深度下能够覆盖约1,070万个 distinct CpGs，占全基因组2,880万个CpGs的约37%。
aMAPP鉴定癌症样本中的差异甲基化区域
在结直肠癌样本中应用aMAPP结合超低深度测序，研究人员在EM-seq转化文库中鉴定出293个高甲基化DMRs，其中158个的beta值≥0.8；在TAPS转化文库中发现55个低甲基化DMRs，其中29个的beta值≤-0.8。这些DMRs中包含多个已知的结直肠癌生物标志物，如SEPTIN9、GATA4、CDH4等。相比之下，标准EM-seq和TAPS文库在相同测序深度下仅分别检测到16个和3个DMRs。值得注意的是，aMAPP检测到的高甲基化DMRs中有86.6%与CGI区域相关，低甲基化DMRs中也有70.9%与CGI相关。
aMAPP检测低频率DMRs的灵敏度
研究人员通过将肿瘤DNA稀释在正常DNA或正常cfDNA中，测试aMAPP检测低水平甲基化的能力。实验表明，aMAPP能够在0.01%的肿瘤DNA稀释比例下检测到高甲基化CGIs，例如位于NKX6-2基因附近的CGI（chr10:132783854-132789145）。即使在cfDNA背景下，aMAPP也能有效捕获稀有的甲基化肿瘤DNA，而相同区域在正常cfDNA中显示完全非甲基化状态。
中等测序深度下的DMR检测
当应用aMAPP结合中等测序深度（约1,000万reads）对5对结直肠癌样本进行分析时，研究人员在5个肿瘤中分别检测到6,664、6,691、8,834、5,669和4,534个DMRs，其中79.7%、61.2%、78.3%、77.3%和74.1%位于CGI区域内。特别值得注意的是，所有5个样本共同共享387个含有DMRs的CGIs，其中包括SEPTIN9、GATA4、CDH1、SFRP1和SDC2等多个已知的结直肠癌高甲基化生物标志物。
研究结论和讨论部分强调，aMAPP技术提供了独特的 versatility、灵活性和效率，在检测表观遗传变化和鉴定低丰度DMRs方面具有显著优势。与现有技术相比，aMAPP能够在单次实验流程中同时检测高甲基化和低甲基化事件，仅需标准文库制备后的单一PCR步骤，无需合成捕获探针，大大简化了工作流程并降低了成本。虽然aMAPP在稀有等位基因检测灵敏度方面尚未达到ppm级别，但其能够检测到0.01%等位基因频率的甲基化事件，已足以满足许多临床应用需求。
该技术的另一个重要优势在于其可调节的基因组覆盖范围。通过使用单一PP或PPs组合，研究人员可以根据需要从广泛的pan-cancer筛查转向聚焦的癌症特异性panel分析，这种灵活性是其他方法难以实现的。此外，aMAPP还有潜力与单细胞测序技术结合，用于研究细胞群体中的甲基化异质性，或者通过调整PP探针来特异性评估LINE-1等重复元件中的低甲基化事件。
研究人员也指出，与RRBS、MeDIP等甲基化富集技术类似，aMAPP主要靶向癌症中最具生物学意义的区域（CGIs），而对低CpG密度区域的代表性不足。然而，这种特性反而使其特别适合研究启动子相关甲基化事件。在超低深度测序下，aMAPP优先富集CGIs内的CpGs，例如使用八聚体探针的PP在甲基化对照样本中覆盖了约16%的CGIs内总CpGs，而CGIs外区域的CpGs覆盖率仅为约0.5%。
总体而言，aMAPP为表观遗传学研究提供了一个强大而灵活的工具，特别在癌症液体活检、早期检测和疾病监测领域具有广阔的应用前景。其简单、经济、高灵敏度的特点，使得大规模临床样本的表观基因组分析变得更加可行，有望推动DNA甲基化标志物在精准医疗中的广泛应用。
