基于C-rich ssDNA特异性蛋白探针CK13的基因组G-四链体间接检测新方法

《Nucleic Acids Research》：Indirect identification of genomic G-quadruplexes via a small protein probe that specifically recognizes C-rich single-stranded DNA

本研究开发了一种新型小蛋白探针CK13，可特异性识别G-四链体（G4）形成过程中释放的互补C-rich单链DNA（C4），为基因组G4图谱绘制提供了创新工具。研究人员通过结构域工程优化探针亲和力，结合CUT&Tag技术在人细胞中鉴定出数万个G4形成位点。该探针能有效检测被G4结合蛋白占据的G4结构，突破了传统探针的局限性，为研究G4生物学功能及调控机制开辟了新途径。

　　

在基因组中，G-四链体（G-quadruplex, G4）是由鸟嘌呤富集序列形成的四链核酸二级结构，广泛分布于端粒、基因启动子、复制起点等关键功能区域。这些特殊结构参与调控端粒维持、基因转录、DNA复制和重组等重要生物学过程，与细胞分化和癌症发生发展密切相关。然而，如何在细胞内精确检测G4结构的形成位点和动态变化，一直是领域内的重大挑战。

传统G4检测技术主要依赖能与G4结构直接结合的探针，但这些探针容易受到细胞内源性G4结合蛋白的竞争性抑制，导致检测信号偏弱或部分位点漏检。此外，不同G4探针对G4构象的偏好性差异也会影响检测结果的准确性。因此，开发不依赖于直接G4识别的新检测方法具有重要意义。

有趣的是，当基因组DNA中形成G4结构时，其互补链会释放出富含胞嘧啶的单链DNA（C-rich ssDNA）。这为间接检测G4形成提供了新思路。然而，现有的C-rich DNA检测方法主要针对在酸性条件下稳定的i-motif结构，而在中性生理环境下效果有限。

针对这一技术瓶颈，研究团队另辟蹊径，开发了一种名为CK13的小蛋白探针。该探针巧妙组合了人PCBP1蛋白的KH1结构域和hnRNPK蛋白的KH3结构域，能特异性识别G4互补链上的C-rich序列。体外实验表明，CK13对端粒和癌基因MYC启动子等经典G4位点的互补链具有高亲和力和特异性，其识别基序为CCCN_1-7CCC。

研究人员将CK13与CUT&Tag技术相结合，在人类HCT116和HeLa细胞中成功鉴定出数万个C-rich ssDNA位点。令人振奋的是，这些位点与传统G4探针检测到的G4位点高度重叠，且大部分位于基因启动子区域。更重要的是，CK13不仅能检测游离的G4结构，还能识别已被内源性G4结合蛋白（如核仁蛋白NCL和拓扑异构酶1）占据的G4位点，这突破了传统G4探针的技术局限。

关键技术方法包括：蛋白工程构建CK13探针、电泳迁移率变动分析（EMSA）验证结合特性、圆二色谱（CD）分析结构变化、核酸外切酶保护实验、免疫荧光染色以及CUT&Tag高通量测序。研究使用了HCT116、HeLa和HEK293T等人源细胞系。

CK13特异性识别C-rich ssDNA

通过系统优化，研究团队发现CK13对含有两个以上C₃₊重复序列的ssDNA具有高亲和力，解离常数（Kd）在10.79-84.86 nM之间。重要的是，CK13不与poly(dA)、poly(dT)或G-rich序列结合，显示了良好的特异性。

CK13偏好结合未折叠的C4 DNA而非i-motif结构

在不同pH条件下，CK13的结合能力存在显著差异：在中性条件（pH 7.5）下结合最强，而在酸性条件（pH 5.5）下结合较弱。这表明CK13主要识别未折叠的C-rich ssDNA，而非i-motif结构，与iMab抗体形成互补。

CK13与G4识别蛋白可同时结合同一基因位点

实验证明，CK13与G4结合蛋白（G4P、NCL）能同时结合到同一G4形成位点，形成三元复合物。这种共定位现象在基因组范围内广泛存在，说明CK13为检测蛋白结合的G4提供了新手段。

基因组范围内的G4位点检测

CUT&Tag测序分析显示，CK13检测到的位点与G4探针（G4P、BG4）高度重叠，且与内源性G4结合蛋白（NCL、Top1）的结合位点相关性更强。这表明CK13能捕获更多被蛋白占据的G4位点，提供了更全面的G4基因组图谱。

本研究开发了一种新型的G4间接检测方法，通过特异性识别G4形成时释放的C-rich ssDNA，实现了对基因组G4位点的高效检测。CK13探针不仅能检测游离G4，还能识别被内源性蛋白占据的G4结构，突破了传统检测方法的局限性。与iMab相比，CK13在中性生理条件下具有更好的检测效果，为在不同细胞状态和微环境下研究G4动态变化提供了有力工具。

该研究的意义在于：首先，建立了不依赖于直接G4识别的检测新策略，减少了内源性蛋白的竞争干扰；其次，CK13与现有G4探针联合使用，可区分游离和蛋白结合的G4状态，有助于深入理解G4的生物学功能；最后，这种方法为研究G4在基因调控、细胞分化和疾病发生中的作用机制提供了新的技术平台。

总之，这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究不仅开发了一种高效的G4检测工具，更重要的是开辟了通过检测G4互补链来间接研究G4生物学功能的新途径，对核酸结构生物学和表观遗传调控研究具有重要推动作用。