《Plant Molecular Biology》：Unravelling the molecular mechanisms of vegetative-to-reproductive transition in Cynara cardunculus by RNA-Seq analysis
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本研究通过RNA-Seq技术首次系统揭示了西部野生朝鲜蓟（Cynara cardunculus L.）在营养阶段（BBCH stage 4）向生殖阶段（BBCH stages 5/6）转变过程中的转录组动态。研究鉴定出552个差异表达基因，深入阐述了MADS-box、AP2/ERF等关键转录因子及苯丙烷类、萜类内酯生物合成通路在花发育和重要次生代谢物（如菜蓟苦素）累积中的核心调控作用，为理解其发育可塑性和药用价值开发提供了分子基础。
在地中海盆地，一种名为刺菜蓟（Cynara cardunculus L.）的多年生草本植物悄然生长，它不仅是传统奶酪制造中不可或缺的植物性凝乳剂来源，其未成熟的头状花序也是餐桌上的美味。然而，比起这些实用价值，刺菜蓟更深层的秘密隐藏在它的生命周期中——从长出丛生叶片的营养生长，到抽薹开花、结出果实的生殖生长，这一转变过程涉及极其复杂的分子调控网络。理解这一转变的机制，对于优化这种具有重要药用和工业应用潜力植物的栽培、提高其富含具有生物活性的次生代谢物（如具有抗炎、抗菌特性的倍半萜内酯——菜蓟苦素）的产量至关重要。然而，此前对野生刺菜蓟，特别是其西部亚种（C. cardunculus subsp. flavescens）在这一关键发育阶段的分子事件知之甚少。为此，研究人员在葡萄牙贝雅地区的实验田里，对西部野生刺菜蓟进行了为期数月的追踪，分别在其营养生长期（3月，BBCH stage 4）和生殖生长期（5月，BBCH stages 5/6）采集叶片样本，首次利用DNBSEQ平台进行了转录组测序（RNA-Seq），旨在揭示其营养生长向生殖生长转变的分子图谱。
为开展此项研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，对采集自7个不同基因型的西部野生刺菜蓟叶片样本进行了高质量的RNA提取与测序。其次，利用生物信息学工具对原始测序数据进行质控、比对至刺菜蓟参考基因组，并采用DESeq2软件进行基因差异表达分析，以识别在不同发育阶段显著差异表达的基因。此外，研究还通过高效液相色谱法（HPLC）定量分析了关键次生代谢物菜蓟苦素在叶片中的积累动态。最后，利用基因本体论（GO）和KEGG通路富集分析对差异表达基因的功能进行注释和分类，并利用系统发育分析和启动子顺式作用元件分析探索了关键基因的进化关系和转录调控机制。
Morphological evaluation
形态学评估显示，刺菜蓟在营养生长阶段（阶段4）植株高度和叶面积存在较大变异，但均未出现花序。进入生殖生长阶段（阶段5/6）后，部分基因型开始抽薹并形成花序，花序数量从0到12个不等，表明开花时间存在不同步性。与营养阶段相比，生殖阶段的平均植株高度有所增加，而叶面积略有下降，但无显著差异。这反映了植株生长重心从营养器官向生殖器官的转移。
Cynaropicrin quantification
菜蓟苦素的定量分析表明，其含量在基因型间和不同采收期存在显著变异。总体而言，生殖生长阶段（5月）叶片中的菜蓟苦素平均含量显著高于营养生长阶段（3月）。这表明菜蓟苦素的生物合成与积累与植物的生殖发育密切相关。
Transcriptome profiling
转录组分析共产生了约4700万条原始读数每个样本，经过严格质控后，超过99%的读数被保留用于后续分析。主成分分析（PCA）清晰地将营养阶段和生殖阶段的样本分开，且生殖阶段的样本表现出更大的离散度，反映了其在花序发生和发育过程中的异质性。研究共鉴定出552个差异表达基因（DEGs），其中321个在营养阶段（阶段4）上调表达，231个在生殖阶段（阶段5/6）上调表达。
Identification and classification of DEGs
GO功能富集分析显示，这些DEGs显著富集在氧化还原过程、脂质代谢、防御反应等生物过程，以及苯丙烷生物合成、花药/花粉发育等代谢通路。其中，涉及木质素形成、类黄酮合成和乙酰转移酶活性的基因在营养阶段高表达；而与花发育、倍半萜内酯生物合成相关的基因则在生殖阶段占主导地位。MADS-box和乙烯响应因子等转录因子家族在调控这一发育转变中起关键作用。
Genes highly up-regulated in the vegetative stage (stage 4)
在营养阶段特异性高表达的基因中，包括多个与花发育相关的MADS-box基因，如EJ2、AP1、TDR4、AP3-2、AGL65、AGL29、MADS50等，以及bZIP43、BBX32等转录因子。一些参与胁迫响应和防御的基因，如热激转录因子（HSFA4C, HSFA2C, HSFA2B）、乙烯响应转录因子（ERF2, ERF1B）、WRKY转录因子（WRKY46）也在此阶段上调。此外，多个受体样蛋白（RLP35, RLP49等）和半胱氨酸蛋白酶（SAG39）等与花药花粉发育和防御反应相关的基因在营养阶段表达更高。在次生代谢方面，参与苯丙烷途径的木素形成阴离子过氧化物酶、PER72、PER12，以及花青素还原酶（ANR）等基因在营养阶段上调。在倍半萜内酯合成通路中，黄瓜二烯醇葡萄糖基转移酶（UGT75L6）、β-石竹烯合酶和（E）-β-法尼烯合酶等在营养阶段表达更高。
Genes highly up-regulated in the reproductive stage (stage 5/6)
在生殖阶段高表达的基因中，花发育关键调控因子AGAMOUS-like MADS-box蛋白AP1（AP1）、AGL9同源物（AGL9/FBP2）和光敏色素A1（PHYA1）显著上调。多个转录因子如乙烯响应转录因子（ERF034, SHINE3）、WRKY转录因子4、bHLH118和脱水响应元件结合蛋白1D（DREB1D）也在此阶段表达升高。在花药花粉发育通路中，受体样蛋白50（RLP50）、受体样蛋白46（RLP46）、多聚半乳糖醛酸酶抑制剂（pgip）和YLS3蛋白（YLS3）表达上调。防御反应相关基因MLP-like protein 28（MLP28）在生殖阶段表达更高。苯丙烷生物合成途径中的过氧化物酶N1（poxN1）、β-葡萄糖苷酶12（BGLU12）、BGLU24、O-乙酰基千金藤碱氧化酶（ASO）、4-香豆酸-CoA连接酶样6（4CLL6）、可能的肉桂醇脱氢酶（CAD2）、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶（HST）、网状青霉素氧化酶（BBE1）、过氧化物酶42（PER42）和没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶（UGT84A13）在生殖阶段上调。倍半萜内酯生物合成通路中的UDP-葡萄糖基转移酶75C1（UGT75C1）、可能的萜类合酶11（TPS11）、可能的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶2（Os07g0190000）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPS1）和黄瓜二烯A合酶长型等在生殖阶段表达量更高。
Phylogenetic relationships of the analyzed proteins
对21个代表性DEGs编码的蛋白质进行的系统发育分析显示，这些蛋白质根据功能家族形成了明显的聚类。萜类合酶（如黄瓜二烯A合酶、E-β-法尼烯合酶和可能的萜类合酶11）形成一个高支持度的单系群。过氧化物酶蛋白（如PER72、poxN1和木素形成阴离子过氧化物酶）也紧密聚类。MADS-box转录因子AGL8和AGL9，以及乙烯响应转录因子SHINE3和ERF2也分别形成支持度较高的分支。这表明这些基因家族在进化上具有保守的起源和功能。
Protein motif identification
MEME套件鉴定了这些蛋白质序列中的保守基序。最显著的基序（MEME-1）富含碱性氨基酸，是MADS-box转录因子DNA结合域的特征。第二个基序（MEME-2）在过氧化物酶序列中检测到，可能与催化活性有关。第三个基序（MEME-3）也在部分过氧化物酶中发现。这些保守基序反映了蛋白质的功能特性。
Promoter sequence and cis-regulatory element analysis
对21个基因启动子序列（1500 bp）的分析发现了三个保守的DNA基序，这些基序具有高GC含量或TA模式。PlantCARE数据库注释发现了丰富的顺式作用调控元件，包括核心启动子元件（如TATA-box、CAAT-box）、激素响应元件（如ABRE、AuxRE、GARE-motif、ERE）、光响应元件（如G-box、Box 4）以及胁迫响应元件（如ARE、MBS）。这些元件的存在表明这些基因的表达受到发育、激素、光和胁迫信号等多种因素的复杂调控。
Correlation analysis
代谢物-转录组相关性分析发现5个基因的表达与菜蓟苦素积累水平显著相关（|ρ|≥0.70）。其中，一个功能未知的基因（V2_12g002980）的表达与菜蓟苦素含量呈正相关，并在生殖阶段高表达。而另外四个基因（NLP5, OFP8, 类硫氧还蛋白1-1, 和一个功能未知基因）的表达与菜蓟苦素含量呈负相关，且在营养阶段表达更高。这提示这些基因可能直接或间接地参与调控菜蓟苦素的生物合成。
Regulation Patterns of DEGs Directly Linked to Phenylpropanoid Biosynthesis
研究表明，苯丙烷生物合成途径中的多个基因在发育转变中受到差异调控。例如，参与木质素合成的阴离子过氧化物酶、PER72、PER12等在营养阶段上调，可能与营养器官的结构建成和防御相关。而在生殖阶段，一系列参与酚类、类黄酮等化合物合成的酶基因，如4CLL6、CAD2、BGLU12/BGLU24、UGT84A13等表达上调，可能为花序发育、授粉和种子传播提供必要的化合物，并增强生殖器官的防御能力。
Transcriptional control of cynaropicrin biosynthesis during plant development
研究结果综合表明，菜蓟苦素的生物合成在刺蓟菜的生殖生长阶段更为活跃。这与黄瓜二烯A合酶（GAS）及其下游修饰酶（如GAO, COS）等关键基因在生殖阶段的表达模式相符。GAS是菜蓟苦素生物合成途径中的第一个关键酶，其表达与菜蓟苦素浓度存在关联。相反，一些在营养阶段高表达且与菜蓟苦素积累负相关的基因（如NLP5, OFP8），可能通过整合氮信号或作为转录抑制子等方式，在营养生长时期抑制资源向次生代谢（如菜蓟苦素合成）的过度分配。
综上所述，本研究通过整合形态学、代谢组学和转录组学分析，首次详细描绘了西部野生刺菜蓟从营养生长向生殖生长转变过程中的分子蓝图。研究不仅鉴定出大量参与此过程的关键基因和转录因子，还揭示了重要活性物质菜蓟苦素积累的转录调控基础。这些发现深化了对菊科植物生殖发育和次生代谢调控网络的理解，为通过分子育种手段提高刺菜蓟的农艺性状和药用价值提供了重要的理论依据和基因资源。该研究结果发表于《Plant Molecular Biology》期刊。
