铜绿假单胞菌噬菌体HKPH_J3的特性及其抗生物被膜功效与耐药机制研究

《International Journal of Medical Microbiology》：Characterization and antibiofilm efficacy of the Pseudomonas aeruginosa phage HKPH_J3

本研究针对抗生素耐药性蔓延下铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为ESKAPE超级耐药病原体的治疗难题，分离了一株新型烈性噬菌体HKPH_J3，系统评价其基因组特征、裂解活性、抗生物被膜能力及体内外抗菌功效，并解析宿主通过IV型菌毛（T4P）合成蛋白PilP无义突变逃逸噬菌体感染的分子机制。结果表明HKPH_J3具有高效裂解活性、显著生物被膜抑制/降解能力及体内保护作用，为耐药PA感染的治疗提供新策略，同时揭示细菌-噬菌体互作进化规律。

　　

在抗生素滥用导致耐药菌泛滥的当下，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为ESKAPE超级耐药病原体的一员，已成为临床治疗的重大挑战。这类细菌不仅能通过外排泵突变、基因水平转移等机制抵抗多种抗生素，更擅长形成顽固的生物被膜（biofilm），像“防护罩”一样抵御药物和免疫系统的攻击。尤其令人担忧的是，碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌已被世界卫生组织列入最高优先级病原体清单，而传统抗生素研发速度远不及细菌耐药性进化速率。在这一背景下，噬菌体治疗（phage therapy）作为靶向裂解细菌的“天然杀手”，重新成为抗感染领域的热点。

本研究从海口人民医院污水样本中分离到一株新型烈性噬菌体HKPH_J3，通过电镜观察、基因组测序、抗生物被膜实验、细胞毒性检测及大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型，系统评估其生物学特性与治疗潜力，并深入解析细菌通过IV型菌毛（type IV pili, T4P）受体突变产生噬菌体耐药的机制。该研究发表于《International Journal of Medical Microbiology》，为噬菌体疗法的临床应用提供理论依据和候选菌株。

在方法学上，作者主要采用噬菌体分离纯化与透射电镜形态观察、全基因组测序与系统发育分析、温度/pH稳定性测定、一步生长曲线与裂解动力学实验、结晶紫染色与激光共聚焦显微镜（CLSM）评估生物被膜、细胞毒性（CCK-8/LDH检测）及大蜡螟感染模型验证体内疗效，并通过基因组重测序与回补实验鉴定耐药突变位点。

3.1 噬菌体分离与形态分析

从医院污水样本中分离的HKPH_J3噬菌体在双层层板上形成透明空斑，电镜显示其具正十二面体头部（直径约63.27 nm）和非收缩性长尾（190.12 nm），属于有尾噬菌体目（Caudovirales）（图1）。

3.2 基因组序列分析

HKPH_J3为线性双链DNA病毒，基因组长度38,008 bp，GC含量64.6%，未携带毒力或耐药基因。注释发现56个功能蛋白基因，包括噬菌体结构基因、DNA复制调控基因和包装基因，归属Casadabanvirus属（图2）。

3.3 噬菌体系统发育分析

基于末端酶大亚基构建的系统发育树显示，HKPH_J3与Pseudomonas phage vB_PaeS_PAO1_HW12等同属菌株亲缘关系最近，基因组共线性分析揭示其与同源噬菌体存在基因重排现象（图2C）。

3.4 温度与pH稳定性

HKPH_J3在0–40°C和pH 6–9范围内活性稳定，高温（>40°C）和强酸/碱环境易致失活（图3）。

3.5 MOI、一步生长曲线与裂解动力学

最佳感染复数（MOI）为0.1，潜伏期60分钟，爆发期40分钟，平均裂解量达369 PFU/细胞。噬菌体处理显著抑制PAO1生长（OD₆₀₀稳定于0.6，对照组达2.0）（图4）。

3.6 噬菌体对生物被膜形成与清除的影响

HKPH_J3可剂量依赖性抑制PAO1生物被膜形成（10⁹PFU/mL时抑制率>80%），并对成熟生物被膜具降解作用（10⁴PFU/mL即可降解50%）（图5）。

3.7 噬菌体抑制PAO1毒力

HKPH_J3本身对A549细胞无毒性，但可显著降低PAO1对细胞的杀伤作用（10¹⁰PFU/mL时细胞毒性降低75%），并减少细菌载量（图6A–C）。

3.8 大蜡螟模型中的治疗效果

在幼虫感染模型中，HKPH_J3注射（10? PFU/mL）使存活率提升至70%，且保护效果呈剂量依赖性（图6D–E）。

3.9 耐药突变体的比较基因组学分析

诱导获得的噬菌体耐药株J3yd_PAO1在pilP基因发生A→T无义突变（K119*），导致IV型菌毛合成蛋白PilP的Pfam结构域截断，可能影响T4P组装（图7A）。

3.10 回补株构建与表型验证

回补pilP基因后，J3yd_PAO1恢复对HKPH_J3的敏感性，噬斑形成与裂解曲线均接近野生型（图7B–C），证实PilP是HKPH_J3吸附的关键受体。

本研究首次报道了Casadabanvirus属噬菌体HKPH_J3通过靶向IV型菌毛实现对铜绿假单胞菌的高效裂解与生物被膜清除，并在感染模型中验证其疗效。同时揭示细菌通过pilP无义突变逃避噬菌体感染的耐药机制，为理解细菌-噬菌体共进化提供分子证据。研究成果不仅为临床耐药PA感染提供新型治疗候选，也为优化噬菌体鸡尾酒疗法、克服耐药性进化策略奠定基础。