《Journal of Biological Chemistry》：A conformation-dependent hydrophobic degron determines Rab9a-mediated vesicular trafficking
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本研究揭示了GDP结合形式的Rab9a通过其Switch I区域暴露的构象依赖性疏水降解决定子被BAG6-RNF126-VCP/p97蛋白质量控制机器识别并降解的分子机制。研究人员发现该降解过程对于维持阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体正确的胞内定位及囊泡运输至关重要，为解决Rab GTPase的构象特异性降解及其在膜运输质量控制中的作用提供了新见解。
在细胞这个精密运转的微观世界里，囊泡运输系统如同城市的物流网络，确保各种“货物”能够准确无误地送达目的地。小GTP酶Rab家族是这一系统的关键调控者，它们通过GDP/GTP循环切换激活与失活状态，精确控制着囊泡的生成、移动、锚定和融合。其中，Rab9a主要负责介导晚期内体到高尔基体的逆向运输，特别是阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体的运输过程。这种受体对于新合成的溶酶体酶类从高尔基体到内体的正确输送至关重要，其功能失常会直接导致溶酶体生物合成和稳态的破坏。
有趣的是，早期的研究发现，一种参与蛋白质质量控制的泛素连接酶RNF126的功能失常也会扰乱CI-M6PR的运输，但其中的具体机制一直是个未解之谜。这提示我们，蛋白质质量控制机制可能以某种方式参与了囊泡运输的精细调控。
为了解决这一科学问题，来自东京都立大学的Jun Shirai、Toshiki Takahashi和Hiroyuki Kawahara研究团队展开了一项深入研究。他们发现了一个令人惊讶的现象：与它系统发育上最接近的同源蛋白Rab7a不同，GDP结合形式的Rab9a在细胞中极其不稳定，半衰期不足1小时，而其GTP结合形式却十分稳定。这种核苷酸依赖性的不稳定性背后，究竟隐藏着怎样的细胞调控逻辑？
为了揭示这一谜题，研究人员进行了一系列精巧的实验。他们比较了Rab9a与Rab7a的氨基酸序列，发现Rab9a的Switch I环区域存在两个独特的疏水残基——亮氨酸36和苯丙氨酸37。在GDP结合状态下，这两个残基的疏水侧链会暴露在蛋白质表面。研究人员将这一结构特征定义为“构象依赖性疏水降解决定子”。当他们将这两个疏水残基突变为Rab7a中对应的亲水残基后，GDP结合的Rab9a稳定性显著增加。相反，如果在原本稳定的Rab7a的对应位置引入Rab9a型的疏水残基，则会使其变得不稳定。这些实验证明，CDH降解决定子是决定Rab9a不稳定性的关键因素。
那么，细胞是如何识别这一降解决定子并降解Rab9a的呢？研究人员发现，细胞质中的分子伴侣BAG6能够特异性识别并结合GDP结合的Rab9a，进而招募泛素连接酶RNF126对其进行多聚泛素化修饰，最终通过蛋白酶体途径降解。此外，他们还鉴定出VCP/p97 ATP酶及其衔接蛋白FAF2/UBXD8也参与了这一降解过程。当使用VCP抑制剂NMS-873处理细胞或用siRNA敲低BAG6、RNF126的表达时，GDP结合的Rab9a稳定性显著增加。
这项研究最引人入胜的部分在于其功能验证。当研究人员在细胞中表达不能被正常降解的CDH降解决定子突变型Rab9a时，CI-M6PR的正常定位被破坏，其在细胞质中呈现分散分布，而非正常的核周高尔基体区域富集。这一表型与Rab9a敲低或PQC机器功能缺陷时观察到的现象相似，表明CDH降解决定子介导的Rab9a降解对于维持正常的CI-M6PR运输是必需的。
本研究主要采用了以下关键技术方法：利用环己酰亚胺追踪实验分析蛋白质半衰期；通过点突变技术构建Rab9a和Rab7a的各种突变体；使用免疫共沉淀技术验证蛋白质间的相互作用；应用蛋白质免疫印迹技术检测蛋白质表达和泛素化修饰；通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察CI-M6PR的细胞内分布；利用siRNA介导的基因敲低和小分子抑制剂处理验证特定蛋白的功能。
GDP-bound Rab9a是HeLa细胞中极不稳定的蛋白
研究人员通过CHX追踪实验发现，GDP结合的Rab9a-S21N突变体半衰期极短（<1小时），而GTP结合的Rab9a-Q66L和野生型Rab9a则十分稳定。蛋白酶体抑制剂MG-132和硼替佐米能延缓Rab9a-S21N的降解，而溶酶体抑制剂则无此效果，表明Rab9a的降解依赖于蛋白酶体途径。
构象依赖性疏水降解决定子决定Rab9a的不稳定性
通过比较Rab9a与Rab7a的Switch I区域，研究人员发现Rab9a特有的Leu36和Phe37在GDP结合状态下暴露疏水性，构成CDH降解决定子。将这两个残基突变为亲水残基（LF-YK或LF-QE突变）能显著稳定GDP结合的Rab9a。相反，在Rab7a的对应位置引入疏水残基（YK-LF突变）则会 destabilize Rab7a。
CDH降解决定子被BAG6相关的泛素连接酶识别
免疫共沉淀实验显示，内源性BAG6和过表达的RNF126能特异性结合GDP结合的Rab9a-S21N，而不结合GTP结合的Rab9a-Q66L或CDH降解决定子突变体。RNF126敲低能稳定Rab9a-S21N并减弱其多聚泛素化。GDP结合的Rab9a-S21N能被FK2抗体检测到多聚泛素化修饰，且这一修饰依赖于RNF126。
VCP作为CDH降解决定子依赖性清除的介导因子
研究发现VCP及其衔接蛋白FAF2能与GDP结合的Rab9a-S21N相互作用，且这一相互作用依赖于CDH降解决定子。VCP抑制剂NMS-873或FAF2敲低能稳定Rab9a-S21N。RNF126敲低减弱了VCP与Rab9a-S21N的结合，表明泛素化是VCP识别Rab9a的前提。
CDH降解决定子介导的Rab9a不稳定性对CI-M6PR的正确分布至关重要
BAG6或RNF126敲低的细胞中，CI-M6PR的分布出现异常，从核周高尔基体区域分散至细胞质周边。表达不能被降解的CDH降解决定子突变型Rab9a（S21N LF-YK）同样引起CI-M6PR的错误定位，而野生型Rab9a或Rab9a-S21N则无此效应。
本研究系统阐明了GDP结合的Rab9a通过其Switch I区域特有的CDH降解决定子被BAG6-RNF126-VCP/p97蛋白质质量控制机器识别和降解的分子机制。这种构象特异性的降解对于维持Rab9a的正常功能至关重要，确保CI-M6PR的正确胞内运输和定位。不仅揭示了Rab GTPase蛋白稳定性调控的新机制，还为理解蛋白质质量控制系统在囊泡运输中的重要作用提供了新的视角。对认识相关溶酶体储存疾病及细胞内运输障碍的病理机制具有重要启示。
