《Journal of Chromatography A》：Antigen Affinity Chromatography for Functional Separation and Efficient Characterization of Critical Monoclonal Antibody Variants
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单克隆抗体（mAb）生产中后端修饰影响抗原结合，本研究开发基于分析抗原亲和色谱的模块化工作流程，通过线性pH梯度（7.4-2.5）分离结合缺陷的mAb变种，结合SPR、SEC、IEC等验证关键修饰（如HC-D102异构化、LC-N30 Asu形成），并成功迁移验证于两个新mAb。
朱莉娅·鲍迈斯特（Julia Baumeister）| 米里亚姆·埃尔哈特（Miriam Erhardt）| 约翰内斯·G·威廉（Johannes G. Wilhelm）| 凯文·林（Kevin Lam）| 西比勒·埃伯特（Sybille Ebert）| 弗兰克·罗森瑙（Frank Rosenau）| 米凯拉·布莱希（Michaela Blech）| 马科·德林（Marco Dehling）| 法比安·希格尔（Fabian Higel）
全球发展部门，CMC Biologicals，勃林格殷格海姆制药有限公司（Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG），德国比伯拉赫安德尔里斯（Biberach an der Riss）
摘要
单克隆抗体（mAbs）在生产和储存过程中容易发生翻译后修饰，这些修饰可能会影响产品质量。互补决定区（CDRs）内的修饰会损害抗原结合能力，因此被视为关键的质量属性。我们开发了一种模块化工作流程，利用分析型抗原亲和层析法根据抗体的抗原亲和力对其进行功能分离。该流程以曲妥珠单抗（trastuzumab）及其抗原——人表皮生长因子受体-2（Her2）作为研究对象进行了优化。通过线性pH梯度（pH 7.4 - 2.5）分离出结合缺陷变异体，并通过表面等离子体共振（SPR）、尺寸排阻层析（SEC）、离子交换层析（IEC）、毛细管凝胶电泳（CGE）-还原反应以及肽图谱分析对这些变异体进行了表征。研究发现，HC-D102异构化和LC-N30琥珀酰亚胺（Asu）的形成等关键修饰会导致结合能力下降，其中HC-D102异构化的影响最为显著。结合缺陷变异体的结合能力降低了多达6%。该流程还被应用于另外两种单克隆抗体，证明了其通用性。对于mAb1，HC-CDR异构化和Asu的形成使其结合活性降低了10%；而对于mAb2，则分离出了结合活性差异范围从2%到66%的多种变异体。在mAb2中，发现HC-CDR和LC-CDR中的Asu形成是导致结合能力下降的主要修饰，并且在类似生理条件的（37°C，pH 7.4）下这种修饰是不可逆的。这种方法能够有针对性地识别关键修饰，有助于早期风险缓解，并在开发过程中制定控制策略，同时确保对单克隆抗体变异体进行全面表征。
引言
治疗性单克隆抗体（mAbs）在生产和储存过程中会因各种应激条件而发生不同的翻译后修饰。这些修饰包括C端或N端的异质性、二硫键的变化，以及单个氨基酸的氧化、脱酰胺或异构化等。此外，聚集、片段化和不同的糖基化模式也会导致单克隆抗体的微异质性。这些修饰可能会影响产品质量，进而影响其安全性和有效性。[1],[2],[3],[4],[5] 对于治疗性单克隆抗体而言，其与抗原及各种Fc受体的结合能力至关重要。单克隆抗体的互补决定区（CDRs）负责抗原结合。CDRs的修饰可能会削弱甚至消除抗原结合能力。然而，并非所有CDR中的氨基酸残基在抗原结合中都起相同的作用。根据这些氨基酸残基对抗原结合的影响程度，可以将其修饰归类为关键或非关键的质量属性，这一分类依据ICH Q8（R2）指南。近年来，单克隆抗体的研发越来越注重早期识别潜在问题，以降低药物开发过程中与稳定性和生物活性相关的风险。[6],[7],[8] 甲基氨酸或色氨酸的氧化可以通过使用过氧化氢等氧化剂进行氧化应激实验来研究。[9] Asn的脱酰胺和Asp的异构化通过涉及天冬氨酸琥珀酰亚胺（Asu）中间体的复杂相互关联途径发生，这些过程受pH值和温度的影响。[10] 这些修饰主要由氨基酸序列决定。Asn脱酰胺通常发生在NG、NS、NT、NN和NH等位点，而Asp异构化则常见于DG、DS、DD等位点。[6,11] 片段化通常发生在铰链区域以上，但也有可能发生在DD、SS或DP等残基之间。[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18] 因此，可以通过计算机模拟（in silico）筛选来评估候选药物中的潜在序列和/或结构相关问题。[19],[20],[21],[22] 尽管序列工程可以通过去除降解热点来解决某些问题，但某些对结合至关重要的残基无法改变。此外，并非所有问题都能仅通过序列或结构分析准确预测，因为还存在一些未知的修饰模式，而且并非所有预测的问题都会导致降解。[6] 因此，对治疗性单克隆抗体变异体进行彻底表征至关重要，随后需要评估这些修饰的功能影响。IgG的双价特性使得表征工作更加复杂，因为应激条件下的修饰分布通常遵循二项分布。通常，氨基酸修饰首先随机发生在单个Fab臂上，只有在长时间应激或施加更严格条件后，两个Fab臂上才会同时出现修饰。因此，保留未修饰Fab臂的结合活性尤为重要。
在进行了氧化、pH值和光照应激条件下的强制降解研究后，常用的变异体表征工作流程包括使用离子交换层析（IEC）、尺寸排阻层析（SEC）或疏水相互作用层析（HIC）来富集目标变异体，目的是使每个分离组分只包含一种修饰类型。分离后，通过肽图谱分析对这些变异体进行鉴定和表征。随后评估它们的抗原结合能力，并据此判断其关键性。[24],[25],[26],[27],[28] 该流程耗时且资源密集。尽管在变异体制备方面付出了努力，但由于共洗脱现象，尤其是对于低丰度变异体来说，实现足够的纯度和数量仍具有挑战性。因此，单独评估每种修饰较为困难。此前也有其他替代方法被探索过。例如，利用SEC分析应激单克隆抗体与其抗原孵育过程中的竞争结合情况，随后通过肽图谱分析结合和未结合的抗体。[29],[30],[31] 然而，确定单克隆抗体与抗原之间的竞争比例以及准确分离出因关键修饰导致结合能力下降的未结合抗体是一个挑战。此外，在存在多个关键修饰时，区分这些修饰的关键性也比较困难。此外，这些实验还需要足够的色谱分辨率。抗原的尺寸应足够大，以便在结合到单克隆抗体时引起SEC洗脱时间的改变。为了解决这个问题，张等人开发了竞争结合质谱（competitive binding-mass spectrometry，MS）这一高通量方法，利用固定化的抗原来富集结合缺陷的单克隆抗体变异体。定量质谱通过比较这些变异体的相对丰度来评估修饰，成功识别了影响抗原结合的修饰。[32] 另一种方法是利用固定在柱子上的抗原来富集变异体。抗原亲和层析技术是一种有前景的方法，可用于分离抗原结合缺陷的变异体。与物理化学分离技术不同，抗原亲和层析能够实现单克隆抗体变异体的功能分离，从而简化了关键性评估的工作。一些研究结合了在线液相层析-质谱（LC-MS）技术，用于CD3抗原的研究，或者使用半制备型抗原亲和层析技术研究I型细胞因子受体和单克隆抗体。[33,34]
本研究提供了一种基于抗原亲和层析的模块化工作流程，用于变异体表征和修饰关键性的评估，解决了现有工作流程无法适应不同单克隆抗体及其抗原的问题。该方法将抗原固定在柱子上，并利用线性pH梯度根据单克隆抗体的抗原亲和力依次洗脱它们，同时保持单克隆抗体和抗原的功能性。提供了优化柱子尺寸和梯度设置的步骤，以分离结合受损和结合缺陷的变异体。通过肽图谱分析对这些变异体进行鉴定和表征。洗脱顺序有助于评估它们的关键性。结合缺陷的变异体通过表面等离子体共振（SPR）得到了验证。随后，可以使用不同的分析方法分析这些组分，以确定它们的保留时间或迁移时间，从而判断其关键性；或者直接使用抗原亲和层析进行监测。该流程以曲妥珠单抗为例进行了开发，该抗体的潜在问题已得到充分研究和报道。最后通过两个单克隆抗体的案例研究验证了该方法的适用性，以评估CDRs中影响抗原结合的特定修饰。
单克隆抗体和抗原
药用级曲妥珠单抗（Herceptin）产品通过合同药房服务从商业渠道采购。重组抗原Her2（无标签，HE2-H5212）从AcroBiosystems购买。mAb1和mAb2通过哺乳动物细胞培养技术（使用中国仓鼠卵巢细胞系）在内部生产，随后进行纯化、配制；相应的抗原1和抗原2则从R&D系统和SinoBiologicals获取。
这些单克隆抗体在应激条件下进行了测试
以曲妥珠单抗为模型蛋白开发模块化工作流程
为了详细表征直接影响生物活性的变异体，我们开发了一种利用抗原亲和层析的工作流程，以曲妥珠单抗及其抗原——人表皮生长因子受体-2（Her2）作为研究对象。曲妥珠单抗是一个典型的例子，其CDRs中存在两个脱酰胺热点（N30、N55）和一个异构化位点（D102）。[35],[36],[37] 由于这些修饰靠近抗原，特别是Asn的脱酰胺
结论
通过分析型抗原亲和层析对结合缺陷变异体进行功能分离，可以方便地分离出足够的材料，以便有针对性地识别关键修饰并评估其关键性。这有助于分离出结合缺陷的变异体，并将这些组分引入分析方法中，从而为控制策略提供依据，明确分析中最相关的峰值。
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写本文的过程中，作者使用了ChatGPT和CoPilot工具来提高文章的可读性和语言表达。使用这些工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。
作者贡献
朱莉娅·鲍迈斯特（Julia Baumeister）：撰写初稿、可视化处理、方法设计、实验研究、数据分析、概念构建。
米里亚姆·埃尔哈特（Miriam Erhardt）：方法设计。
约翰内斯·威廉（Johannes Wilhelm）：撰写、审稿与编辑、方法设计、实验研究。
凯文·林（Kevin Lam）：方法设计。
西比勒·埃伯特（Sybille Ebert）：撰写、审稿与编辑、监督工作。
弗兰克·罗森瑙（Frank Rosenau）：撰写、审稿与编辑、监督工作。
米凯拉·布莱希（Michaela Blech）：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源协调。
马科·德林（Marco Dehling）：撰写、审稿与编辑、监督工作。
CRediT作者贡献声明
朱莉娅·鲍迈斯特（Julia Baumeister）：撰写初稿、可视化处理、方法设计、实验研究、数据分析、概念构建。
米里亚姆·埃尔哈特（Miriam Erhardt）：方法设计。
撰写、审稿与编辑、方法设计、实验研究。
凯文·林（Kevin Lam）：方法设计。
西比勒·埃伯特（Sybille Ebert）：撰写、审稿与编辑、监督工作。
弗兰克·罗森瑙（Frank Rosenau）：撰写、审稿与编辑、监督工作。
米凯拉·布莱希（Michaela Blech）：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源协调。
马科·德林（Marco Dehling）：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
朱莉娅·鲍迈斯特（Julia Baumeister）、米里亚姆·埃尔哈特（Miriam Erhardt）、约翰内斯·G·威廉（Johannes G. Wilhelm）、凯文·林（Kevin Lam）、米凯拉·布莱希（Michaela Blech）和法比安·希格尔（Fabian Higel）均为勃林格殷格海姆制药有限公司（Boehringer Ingelheim GmbH & Co. KG）的员工，该公司负责生物制药产品的研发、生产和销售。
致谢
作者感谢Nora Hann、Elena Westner和Andreas Petzold协助进行SPR测量工作，同时也感谢Marianne Scheffold在肽图谱分析中的支持。
