《Journal of Chromatography B》：Identification of antithrombotic active components in Xuefu Zhuyu decoctionby thrombin targeted affinity ultrafiltration mass spectrometry
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抗血栓活性成分的高效筛选方法：本研究采用亲和超滤-超高效液相色谱-四维飞行时间质谱联用技术（AUF-UPLC-Q-TOF-MS），通过血栓靶向筛选，从Xuefu Zhuyu Decoction中成功鉴定出7个抗凝血成分（结合率＞10%），首次证实Rhoifolin、Ginsenoside Ro和Licoricesaponin G2具有显著抗血栓活性，较传统分离纯化法节省90%样品和80%时间成本。
邹婷|何向昌|袁志英|何伟贺|戴杰|李思宇|徐光明
湖南中医药大学药学院，中国长沙410208
摘要
目的
由于筛选化合物活性成分比筛选单一成分更为复杂，我们开发了一种一步法高通量筛选方法，利用亲和超滤-质谱（AUF-UPLC-Q-TOF-MS）技术快速鉴定血府逐瘀汤中的抗血栓活性成分。
方法
本研究采用90%乙醇对50克血府逐瘀汤进行回流提取，随后通过乙酸乙酯、正丁醇和水进行浓缩和依次萃取。选取正丁醇组分作为主要研究对象。以凝血酶为目标，将该组分在37°C下与活性/失活酶孵育40分钟，通过10 kDa超滤管分离复合物。通过UPLC-Q-TOF-MS结合空白对照实验初步筛选潜在配体，并通过分子对接、显色底物测定、三种凝血指标（APTT/PT/TT）和斑马鱼血栓模型进行体外和体内验证。该方法省去了重复柱层析和活性追踪的繁琐步骤，具有样品消耗少、筛选效率高、实验成本和时间低的优点。
结论
AUF-UPLC-Q-TOF-MS从11个差异峰中鉴定了7个结合率超过10%的成分，其中Rhoifolin、人参皂苷Ro和甘草皂苷G2首次被证实具有显著的凝血酶抑制作用。与传统“分离-纯化-验证”方法相比，该方法样品消耗量减少了90%，时间和成本也降低了80%。它为传统中药配方中活性成分的快速、环保和低成本筛选提供了可复制的模板，同时为抗血栓先导化合物的高效发现奠定了坚实的实验基础。
引言
在生物体的心腔或血管中，由于病理原因，血液中的某些成分可能会相互粘附，或者血液会发生凝固，最终形成称为血栓的固体物质。血栓可能发生在动脉或静脉循环中，其形成与血小板、血液和血管壁的异常有关[1]。血栓栓塞性疾病以及心血管和脑血管疾病的死亡率在全球范围内都很高，血栓形成是导致这些疾病的关键因素之一[2]。血栓形成是一个高度复杂的病理过程，其中血小板的过度粘附、激活、聚集和释放是关键因素。当心血管病变发生时，涉及的后续机制众多，与体内的长期炎症状态密切相关。在此过程中，血液淤滞作为潜在风险因素，显著促进了动脉粥样硬化等病理状况的发生和发展。当血液淤滞在血管中积聚时，会严重破坏正常的血管功能和完整性。促进血液循环和消散淤滞的传统中药（TCM）配方，如血府逐瘀汤，在临床中已被广泛用于治疗血液淤滞综合征，并显示出有效的治疗效果[3]。血府逐瘀汤是由清代医生王清仁在其著作《医林改错》中提出的“五瘀汤”之一，是一种用于“胸部区域血液淤滞”的活血化瘀的经典中药配方。该配方包含11种中药，分别是桃仁（Prunus persica (L.) Batsch）、红花（Carthamus tinctorius L.）、当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels）、熟地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）、川芎（Conioselinum anthriscoides “Chuanxiong”）、赤芍（Paeonia anomala L.）、牛膝（Achyranthes bidentata Blume）、桔梗（Platycodon grandiflorus (Jacq.) A. DC.）、柴胡（Bupleurum chinense DC.）、枳壳（Citrus × aurantium L.）和甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.）（所有植物名称均经MPNS验证）[4]，其中桃仁和红花为主要药材，用于活血化瘀；川芎作为辅助药材，与牛膝协同作用，促进血液循环、调节月经和消除淤滞；生地黄和当归滋养血液；桔梗和枳壳扩张胸腔、调节气机；柴胡疏肝解郁。这种“主-辅-佐-使”组合能有效消除淤滞、活血化瘀、健脾理气，特别适用于血液淤滞综合征[5]。然而，目前对血府逐瘀汤的研究主要集中在临床疗效和药理机制上，其具体活性成分尚未得到充分探索。
未来研究应整合先进的分离和分析技术，如亲和超滤-质谱，更高效地鉴定血府逐瘀汤中的关键活性成分，并进一步探索其作用机制，从而为心血管疾病的预防和治疗提供科学依据。超滤技术是一种创新的大规模生物活性物质分离和纯化方法，结合了亲和层析的高选择性和超滤的高处理能力。其原理如下：当目标化合物（亲和体）在提取物中自由存在时，其小分子量使其能够通过高分子量截留值的超滤膜；当亲和体与大分子配体结合形成复合物时，复合物的较大分子量会阻塞超滤膜，将其截留；同时，未结合的成分通过膜并与复合物分离[7]。随后使用液相色谱-质谱（LC-MS）高效分离和鉴定这些释放的活性化合物，实现生物活性物质的快速筛选。AUF-UPLC-Q-TOF-MS技术包括受体和目标配体的初步处理，然后通过LC-MS进行在线检测和分析。实验组与对照组相比，峰值强度和面积较大的峰表明化合物与目标分子发生了特异性结合，有效结合了高效液相色谱的分离能力和质谱的分析精度[8]。与传统分离和筛选方法相比，亲和超滤-质谱具有高选择性、靶向筛选、高通量处理和灵敏度、成本效益以及操作便捷等优点。此外，由于其高选择性、高通量和成本效益，该技术已成为天然产物中活性成分筛选的核心方法，应用范围扩展到药物开发、环境监测等相关领域。
本研究采用亲和超滤-质谱（AUF-UPLC-Q-TOF-MS）技术高效筛选血府逐瘀汤中的抗血栓活性成分。该方法首先建立了基于凝血酶的亲和相互作用模型，然后利用提取物与凝血酶之间的特异性结合特性。成功鉴定出具有抑制作用的候选化合物，为心血管疾病的预防和控制提供了实验依据，同时也为血府逐瘀汤资源的综合利用提供了支持。
AUF条件
为了进一步评估AUF结合实验中应用的孵育条件的合理性，进行了显色底物测定作为辅助评估。在此实验中，首先固定温度和酶浓度等关键参数以确保最佳的凝血酶活性。在这些条件下，样品浓度成为影响实验结果的主要因素。浓度不足可能导致
体外凝血因子检测
本研究（见表2）通过测量兔血浆中的活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT），研究了不同活性成分对凝血途径的调节作用。结果表明：当Rhoifolin浓度增加到0.8 g·L?1时，APTT显著延长，表明其对凝血活酶途径具有浓度依赖性效应。人参皂苷G在所有三种浓度下均显著延长了APTT
结果与讨论
血栓栓塞性疾病对全球公共卫生构成严重威胁。以血府逐瘀汤为代表的传统中药配方在抗血栓治疗中显示出显著的临床疗效，但其活性成分尚未完全阐明。
本研究采用基于凝血酶靶向的亲和超滤结合超高效液相色谱-四极杆飞行质谱的高通量筛选策略
结论
本研究创新性地建立了基于凝血酶靶向的亲和超滤结合UPLC-Q-TOF-MS的高通量筛选策略，不仅填补了快速鉴定血府逐瘀汤中抗血栓活性成分的空白，还为复杂中药配方中活性物质的高效筛选提供了可复制的技术范式。与传统繁琐的“分离-纯化-验证”方法不同
动物伦理问题
所有涉及动物的实验和程序均遵循湖南中医药大学动物实验中心的动物伦理原则进行（批准编号：LLBH-202101070013和LLBH-202205030001），并符合机构和国家卫生研究院的指南。
作者贡献声明
邹婷：方法学、数据管理、概念构建。何向昌：实验研究。袁志英：项目管理。何伟贺：资源协调。戴杰：软件支持。李思宇：结果验证。徐光明：监督和资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本研究由湖南省教育厅重点科研项目资助（编号：24A0276）。
