《Journal of Endocrinology》：OIP5-AS1/miR-335-5p regulates osteoblast proliferation and injury in glucocorticoid-induced osteoporosis in male mice
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本研究聚焦糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIOP）的发病机制。研究人员发现长链非编码RNA OIP5-AS1在GIOP模型中表达上调，并通过海绵吸附miR-335-5p，进而调控乳酸（LA）水平、氧化应激（MDA、SOD）、自噬（LC3-II、P62）以及成骨分化标志物（ALP、RUNX2、OPN、BMP2）的表达。敲低OIP5-AS1可缓解GIOP的病理进程，表明OIP5-AS1/miR-335-5p轴是GIOP的潜在治疗靶点，为开发新的抗骨质疏松策略提供了理论依据。
糖皮质激素是临床上广泛使用的抗炎和免疫抑制剂，然而，长期大剂量使用会带来一个棘手的并发症——糖皮质激素诱导的骨质疏松症（Glucocorticoid-Induced Osteoporosis, GIOP）。这已成为最常见的继发性骨质疏松症类型，其本质是骨形成与骨吸收的平衡被打破，导致骨量减少、骨微结构破坏、骨骼脆性增加，从而大大升高骨折风险。尽管其临床重要性不言而喻，但GIOP的具体分子机制仍未完全阐明，这限制了有效治疗策略的开发。近年来，长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）作为基因表达的关键调控因子，在多种骨骼疾病中的作用逐渐受到关注。其中，lncRNA OIP5-AS1在骨质疏松患者和骨折延迟愈合中表达异常升高，提示它可能参与骨代谢调控。与此同时，微小RNA（microRNA, miR）-335-5p在骨质疏松患者的骨组织中表达下调。那么，OIP5-AS1和miR-335-5p在GIOP中是否存在关联？它们又是如何影响成骨细胞功能，进而参与GIOP发展的？这些疑问促使研究人员展开了深入探索。为了回答这些问题，由Jiefeng Li、Qike Fu、Le Kang、Yahong Gao和Jun Shi组成的研究团队在《Journal of Endocrinology》上发表了一项研究，旨在揭示OIP5-AS1/miR-335-5p轴在GIOP中的作用及其潜在机制。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：首先，他们成功构建了体内和体外GIOP模型，体内模型采用雄性C57BL/6J小鼠，通过皮下注射不同剂量地塞米松（Dex）模拟GIOP；体外模型则使用小鼠成骨细胞系MC3T3-E1，通过地塞米松处理诱导。其次，他们运用了实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术检测了OIP5-AS1、miR-335-5p、自噬相关基因（LC3-II, P62）以及成骨分化标志物（ALP, RUNX2, OPN, BMP2）的mRNA表达水平。第三，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估了细胞增殖能力。第四，利用双荧光素酶报告基因（DLR）实验验证了OIP5-AS1与miR-335-5p之间的直接靶向结合关系。第五，通过Western blot蛋白印迹技术分析了PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的磷酸化水平。此外，还使用了商业试剂盒检测了乳酸（LA）含量以及氧化应激指标（MDA, SOD）。
Effects of different Dex concentrations on OIP5-AS1, BMD, and lactate levels in mice
研究人员首先通过给小鼠注射不同剂量地塞米松成功构建了GIOP模型。他们发现，随着地塞米松浓度的增加，小鼠体内OIP5-AS1的表达水平逐渐升高，而骨密度（BMD）则呈现相反趋势，显著下降。同时，乳酸水平也随地塞米松剂量的增加而显著上升。这些结果表明OIP5-AS1和乳酸代谢与GIOP的严重程度密切相关。
Levels of autophagy, oxidative stress, and bone formation markers in the GIOP mouse model
在GIOP小鼠模型中，研究人员进一步检测了自噬、氧化应激和骨形成标志物的水平。与对照组相比，GIOP小鼠血清中的氧化应激指标丙二醛（MDA）表达显著升高，而超氧化物歧化酶（SOD）水平明显降低，表明小鼠处于氧化应激状态。同时，自噬相关基因LC3-II的mRNA水平显著升高，而P62的mRNA水平显著降低，提示细胞自噬活性增强。此外，成骨分化标志物ALP、RUNX2、OPN和BMP2的水平均显著降低，说明GIOP小鼠的骨形成能力受损。
Impact of OIP5-AS1 knockdown on lactate levels, proliferation, oxidative stress, and autophagy in MC3T3-E1
为了探究OIP5-AS1的功能，研究人员在体外GIOP细胞模型（MC3T3-E1细胞）中敲低了OIP5-AS1的表达。结果显示，敲低OIP5-AS1后，细胞内miR-335-5p水平升高，乳酸水平下降，细胞增殖能力增强。同时，氧化应激水平（MDA降低，SOD升高）得到缓解，细胞自噬行为（LC3-II降低，P62升高）受到抑制。更重要的是，成骨分化标志物ALP、RUNX2、OPN和BMP2的表达水平均显著上升，表明成骨细胞的分化能力得到恢复。
Targeted binding of OIP5-AS1 to miR-335-5p
通过生物信息学分析（ENCORI数据库）和双荧光素酶报告基因实验，研究人员证实了OIP5-AS1与miR-335-5p之间存在直接的靶向结合位点。当共转染miR-335-5p模拟物时，野生型OIP5-AS1报告载体的荧光素酶活性显著降低；而转染miR-335-5p抑制剂则产生相反效果。突变型OIP5-AS1的荧光素酶活性不受影响。这直接证明了OIP5-AS1作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miR-335-5p。
OIP5-AS1 and miR-335-5p affect proliferation, autophagy, and oxidative stress levels in osteoblasts
研究人员进一步验证了OIP5-AS1通过miR-335-5p调控成骨细胞功能。敲低OIP5-AS1可升高miR-335-5p，从而降低乳酸水平、增强细胞增殖、减轻氧化应激、抑制自噬。然而，如果在敲低OIP5-AS1的同时抑制miR-335-5p，则上述保护效应被显著逆转，乳酸水平回升，细胞增殖能力下降，氧化应激加重，自噬活性增强。
OIP5-AS1 and miR-335-5p affect osteoblast differentiation
在成骨分化方面，敲低OIP5-AS1显著提升了成骨分化标志物（ALP、RUNX2、BMP2、OPN）的表达水平。然而，当同时抑制miR-335-5p后，这些标志物的表达水平被显著抑制，再次证实了OIP5-AS1通过调控miR-335-5p来影响成骨细胞的分化功能。
Possible involvement of miR-335-5p downstream target genes in the autophagy pathway
通过对miR-335-5p下游靶基因的生物信息学预测（miRDB、miRWalk、TargetScan数据库）和文献调研，研究人员发现KAT7和RBFOX2等基因可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。实验验证表明，敲低OIP5-AS1可激活PI3K/Akt/mTOR通路（p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值升高），而抑制miR-335-5p则抑制了该通路的活性。这一变化趋势与自噬标志物（LC3-II和P62）的变化一致，提示OIP5-AS1/miR-335-5p轴可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路影响成骨细胞的自噬行为。
归纳研究结论和讨论部分，本研究系统地阐明了OIP5-AS1/miR-335-5p轴在GIOP中的关键作用。在GIOP模型中，OIP5-AS1表达上调，通过海绵吸附作用降低miR-335-5p水平，进而导致乳酸积累、氧化应激加剧、自噬过度激活以及成骨分化受损。敲低OIP5-AS1则能逆转这些病理变化，缓解骨质疏松进程。该研究的重要意义在于首次将OIP5-AS1、miR-335-5p、乳酸代谢、氧化应激、自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路联系起来，构建了一个相对完整的GIOP发病机制网络。这不仅深化了对GIOP分子机制的理解，更重要的是为GIOP的治疗提供了新的潜在靶点。未来，开发靶向OIP5-AS1的抑制剂或直接补充miR-335-5p模拟物，可能成为治疗GIOP的新策略。此外，研究也指出未来需要进一步探索乳酸水平影响成骨细胞的具体机制，并在雌性动物模型及临床中验证OIP5-AS1/miR-335-5p轴的转化价值。
