葡萄糖响应性智能释氧抗菌水凝胶通过调控细胞异质性促进糖尿病创面愈合

《Advanced Science》：A Glucose-Responsive Intelligent Antibacterial and Oxygen-Producing Hydrogel Promotes the Healing of Diabetic Wounds by Regulating Cellular Heterogeneity

本文报道了一种新型葡萄糖响应性智能水凝胶（CF-CPGaMPN），其通过动态硼酸酯键实现高糖环境下的按需药物释放，集抗菌（GaMPN纳米颗粒）、持续供氧（PVP@CaO2+过氧化氢酶）和自愈合特性于一体。单细胞测序揭示其通过调控中性粒细胞（抑制S100a9+亚群/招募Slpi+亚群以减少中性粒细胞胞外诱捕网NETs形成）、成纤维细胞（上调Ccl3+亚群/下调Vcam1+亚群）和表皮细胞（促进K16+亚群）异质性，协同缓解组织缺氧、抑制过度炎症并促进血管生成与上皮再生，为糖尿病感染创面愈合提供了创新性治疗策略。

　　

1 引言

糖尿病创面难愈的核心挑战在于持续细菌感染与组织缺氧。本研究开发了一种智能水凝胶CF-CPGaMPN，其由羧甲基壳聚糖（CMCS）、2-甲酰苯基硼酸（2-FPBA）交联形成动态网络，并负载镓-酚醛网络（GaMPN）纳米颗粒、聚乙烯吡咯烷酮包裹的过氧化钙（PVP@CaO₂）纳米颗粒及过氧化氢酶。该水凝胶的硼酸酯键在高葡萄糖环境下断裂，实现GaMPN的按需释放，兼具抗菌、供氧、自愈合和止血功能。

2.1 GaMPN纳米颗粒的制备与表征

GaMPN由单宁酸（TA）、二乙基二硫代氨基甲酸盐（DEDTC）与Ga³⁺通过配位自组装形成球形纳米颗粒（直径25–40纳米）。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）与X射线光电子能谱（XPS）证实Ga–O（酚羟基）与Ga–S（DEDTC）配位键的形成，赋予其通过“特洛伊木马”机制（模拟铁载体被细菌摄取）干扰铁代谢的广谱抗菌能力。

2.2 PVP@CaO₂纳米颗粒的制备与氧释放

PVP@CaO₂纳米颗粒（60–90纳米）在过氧化氢酶作用下与水反应生成Ca(OH)₂和H₂O₂，后者分解为氧气。溶解氧测定显示其可在10分钟内使环境氧浓度升至260 μM，且水凝胶载体可延长氧释放时间、增强组织渗透深度。

2.3 CF水凝胶的合成与表征

CMCS与2-FPBA通过席夫碱反应形成一级交联，2-FPBA的硼酸基团与GaMPN的酚羟基形成动态硼酸酯键，构成双交联网络。扫描电子显微镜（SEM）显示多孔结构，流变学测试证实其自愈合性能（应变1000%破坏后0.1%应变下可快速恢复）。水凝胶还表现出可注射性、组织粘附性及持续氧释放能力。

2.4–2.6 水凝胶的理化性质

振幅扫描显示储能模量（G′）在应变816%内高于损耗模量（G″），证实凝胶态。葡萄糖响应性释放实验表明，在16.7 mM葡萄糖环境中，680分钟内GaMPN累积释放率达89.95%，显著高于PBS组的56.27%。溶胀与降解实验表明水凝胶可维持10天以上凝胶状态，覆盖创面愈合关键期。

2.7 生物相容性评价

Live/Dead染色与CCK-8法显示CF-CPGaMPN水凝胶对L929细胞无显著毒性，细胞形态伸展良好。溶血率低于2%，且在小鼠肝脏出血模型中显著加速止血（凝血指数BCI降低）。这些特性保障了其体内应用安全性。

2.8 体外抗菌性能

对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），CF-CPGaMPN水凝胶通过菌落形成单位（CFU）测定、Live/Dead染色及扫描电子显微镜（SEM）验证其强效杀菌作用。机制包括：CMCS阳离子破坏细菌膜结构；GaMPN通过铁代谢干扰导致细菌死亡（SEM可见部分细菌膜完整但内容物泄漏）。晶体紫染色显示该水凝胶可有效破坏细菌生物膜。

2.9–2.10 体内糖尿病感染创面愈合评价

在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型中，CF-CPGaMPN组在第14天创面愈合率达96.61%，显著高于对照组（71.39%）。组织学（H&E和Masson染色）显示其促进上皮再生、胶原沉积及毛囊形成。免疫荧光显示CD31（血管标记）表达上调、IL-1β（炎症标记）表达下调，表明其促进血管生成并缓解炎症。

2.11–2.15 单细胞RNA测序揭示细胞异质性调控机制

对创面组织的单细胞测序鉴定出11个细胞群，包括成纤维细胞（31.75%）、表皮细胞（21.53%）和中性粒细胞（18.54%）。CF-CPGaMPN处理组中，愈合相关细胞（成纤维细胞与表皮细胞）比例升高，而炎症性中性粒细胞比例下降。中性粒细胞亚群分析发现，水凝胶下调促NETs的S100a9+亚群，上调抑制NETs的Slpi+亚群。轨迹分析显示S100a9+亚群位于分化早期，Slpi+亚群位于后期。成纤维细胞中，水凝胶招募促修复的Ccl3+亚群，抑制炎症相关Vcam1+亚群。表皮细胞中，促迁移增殖的K16+亚群比例增加，而缺氧相关Mki67+亚群减少。KEGG富集分析显示水凝胶下调缺氧诱导因子-1（HIF-1）、晚期糖基化终末产物-受体（AGE-RAGE）和Notch信号通路，上调过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和雌激素信号通路，共同缓解缺氧、抑制过度炎症并促进修复。

2.16 作用机制整合

CF-CPGaMPN水凝胶通过三重机制促进糖尿病感染创面愈合：① 葡萄糖触发释菌与持续供氧，直接对抗感染与缺氧；② 调控关键细胞亚群（中性粒细胞、成纤维细胞、表皮细胞）的异质性，抑制NETs形成、减轻炎症、促进组织重塑；③ 协调多重信号通路（如抑制HIF-1α、Notch1表达），优化修复微环境。

3 结论

CF-CPGaMPN水凝胶作为一种葡萄糖响应的智能递送系统，通过抗菌、供氧及调控细胞异质性协同加速糖尿病感染创面愈合，为慢性创面治疗提供了新材料设计思路与机制见解。

4 实验部分

研究详细阐述了材料合成、表征、体外/体内实验方法，包括纳米颗粒制备、水凝胶构建、抗菌评价、动物模型建立、组织学分析及单细胞测序数据处理流程，确保了实验的可重复性与科学性。