《Journal of Food Protection》：In Vitro and
In Planta Evaluation of
Bacillus Strains Against a Strain of Enteropathogenic
Escherichia coli in Mung Bean Sprouts
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本研究针对绿豆芽易受食源性病原体污染的问题，探索了从绿豆芽中分离的芽孢杆菌菌株作为生物防治剂的潜力。研究人员通过体外和体内实验，筛选出能有效抑制肠致病性大肠杆菌O55:H7在豆芽中定植的芽孢杆菌菌株，并发现菌落形态是预测其防治效果的有效指标。结果表明，菌株MBm1和MBm6等能显著降低病原菌数量4.0-5.4 log CFU/g，且不影响豆芽生长，通过形成生物膜等机制发挥拮抗作用，为开发安全高效的豆芽生物保鲜技术提供了新策略。
鲜嫩可口的绿豆芽是餐桌上的常客，它富含维生素、黄酮、氨基酸等营养成分，甚至含有具有抗菌、抗炎等活性的生物代谢物。然而，这颗小小的豆芽却多次被推上食品安全的风口浪尖。在世界各地，包括加拿大、英国、美国、欧洲以及日本和德国，都曾暴发过与食用受污染的豆芽相关的食源性疾病疫情，其元凶主要是沙门氏菌和致病性大肠杆菌。例如，1996年日本一场由肠出血性大肠杆菌O157:H7引发的疫情导致超过9000人患病，12人死亡；2011年德国的O104:H4疫情则造成4000多人感染，900多例溶血性尿毒综合征和50例死亡。这些触目惊心的数据警示我们，豆芽的安全生产至关重要。
豆芽为何如此容易被污染？祸根往往源自种子本身。在温暖潮湿的发芽过程中，即使初始污染量极低（如0.1 log CFU/g），病原菌也能迅速增殖到很高的水平（6-8 log CFU/g）。虽然业内普遍采用高浓度次氯酸钙等化学消毒剂处理种子，但效果并不总是理想。病原菌可能会潜入种子内部，或者形成具有保护作用的生物膜群落，从而躲过消毒剂的追杀，导致消毒失败。因此，寻找一种更安全、更有效的保障豆芽安全的方法迫在眉睫。生物防治策略，即利用有益的微生物来对抗有害的病原菌，作为一种环境友好的替代方案受到了广泛关注。其中，芽孢杆菌因其能够产生多种抗菌物质并形成耐热的芽孢，被认为是颇具潜力的生物防治剂候选者。
那么，来源于豆芽本身的芽孢杆菌，能否“反戈一击”，成功抑制病原菌在豆芽上的定植呢？发表在《Journal of Food Protection》上的这项研究，正是为了回答这个问题。研究人员以肠致病性大肠杆菌O55:H7为模型病原菌，系统评价了从绿豆芽中分离的多种芽孢杆菌菌株在体外和发芽过程中抑制该病原菌的能力。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们首先使用琼脂平板扩散法快速筛选具有体外拮抗活性的芽孢杆菌菌株。更重要的是，他们建立了一套模拟豆芽生产的实验室发芽系统（使用自制的迷你发芽器），并在此系统中直接评估了所选芽孢杆菌菌株在豆芽发芽过程中实际抑制大肠杆菌O55:H7生长的能力。为了观察微生物在豆芽表面的分布和相互作用，研究人员采用了荧光显微镜（使用GFP标记的大肠杆菌）和扫描电子显微镜，直观地展示了病原菌和拮抗菌的定植情况以及生物膜的形成。此外，还通过体外实验评估了这些芽孢杆菌菌株形成生物膜（包括菌落生物膜和液面菌膜）的能力。实验数据均进行了规范的统计学分析（如ANOVA, Tukey's test）。
In vitroselection of spore-forming bacilli with anti-E. coliactivity
研究人员首先通过琼脂平板扩散法，从150株绿豆芽来源的芽孢杆菌中初筛对大肠杆菌O55:H7有抑制作用的菌株。结果显示，不同菌株的抑制圈大小差异很大（0-15毫米）。值得注意的是，后续发现，这种体外抑制活性并不能可靠地预测该菌株在真实的豆芽发芽环境中抑制病原菌的效果。
Inhibition of E. coliin sprouting seeds
在豆芽发芽实验这个更接近实际应用的模型中，结果出现了显著差异。在体外实验中表现出较强抑制活性的13株菌中，只有MB37和MB130两株菌在豆芽上展现出了强大的拮抗能力，分别使豆芽中的大肠杆菌数量减少了4.0和4.4 log CFU/g，而其他多数菌株效果微弱甚至无效。相反，另一批最初是根据其“粗糙”的菌落形态（这通常与生物膜形成能力相关）筛选出的12株菌，却有7株菌在豆芽模型中表现优异，能将病原菌降低4.5–5.4 log CFU/g。特别引人注目的是菌株MBm6，它在体外实验中完全不抑制大肠杆菌，却在豆芽模型中表现出极强的拮抗效果。这强有力地说明，不能仅凭体外实验的结果来筛选有效的生物防治菌株，菌落形态或许是一个更实用的初筛指标。
Fluorescence microscopy analysis of E. coliand Bacillusinteractions in sprouted seeds
荧光显微镜观察证实，在未添加拮抗菌的对照组豆芽上，GFP标记的大肠杆菌在豆芽的种皮、下胚轴和根尖等部位大量定植并生长。而在添加了拮抗菌MBm6的豆芽上，大肠杆菌的荧光信号则大幅减弱，直观地证明了该芽孢杆菌有效抑制了病原菌的生长和 colonization。
In vitrobiofilm formation capacity of active antagonistic Bacillusstrains
研究发现，所有具有拮抗活性的芽孢杆菌菌株在体外都能形成典型的粗糙菌落（菌落生物膜）和在液体表面形成复杂的褶皱状菌膜（液面菌膜），这表明它们具有很强的生物膜形成能力。
Biofilm formation on sprouted seeds
扫描电镜观察为芽孢杆菌的拮抗机制提供了更深入的线索。在接种了拮抗菌MBm1的豆芽表面（特别是根尖），可以观察到大量的杆菌样细胞，并且这些细胞被包裹在类似胞外聚合物（EPS）的纤维状无定形物质中，形成了典型的生物膜结构。这表明，拮抗菌可能通过快速在豆芽表面定植并形成生物膜，抢占生态位，并分泌抗菌物质，从而排挤和抑制病原菌大肠杆菌。
Effect of antagonistic bacteria on sprout development
一个成功的生物防治剂不应对作物本身有负面影响。研究评估了拮抗菌对豆芽生长的影响。结果显示，大多数有效的菌株（如MBm1, MBm5, MBm6, MBm9, MB37）在显著抑制病原菌的同时，并未对豆芽的长度和重量产生不利影响。但也有个别菌株（如MBm4, MBm10, MBm12, MB130）会抑制豆芽生长，因此在选择应用菌株时需要谨慎。
Antibacterial activity of the antagonistic bacteria against various plant- and human-pathogens
此外，研究人员还测试了这些芽孢杆菌菌株对其它几种植物病原菌（如克莱伯氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、丁香假单胞菌）和人类病原菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）的抑制活性。发现部分菌株具有广谱的抗菌活性，这为开发能应对多种病原菌的生物防治剂提供了可能。
综上所述，本研究得出以下核心结论：从绿豆芽中分离的特定芽孢杆菌菌株，如MBm1、MBm6、MB37和MB130等，能有效抑制肠致病性大肠杆菌O55:H7在豆芽发芽过程中的定植和生长，降低幅度最高可达5.4 log CFU/g。研究强调，体外抗菌活性与在豆芽上的实际防治效果相关性不强，而基于粗糙菌落形态（预示生物膜形成能力）的筛选策略更为有效。芽孢杆菌的拮抗机制可能涉及其在豆芽表面快速定植、形成生物膜、产生抗菌物质、营养竞争以及可能的群体感应淬灭等多重作用。重要的是，一些在豆芽上高效拮抗的菌株（如MBm6）在体外并无抑菌活性，说明豆芽发芽的特定环境可能激发了其抗菌机制。
这项研究的意义在于，它证实了使用豆芽本源芽孢杆菌作为生物防治剂来控制食源性病原菌的可行性。这些菌株对发芽环境适应性强，且多数对豆芽生长无害。研究为开发一种替代化学消毒剂的、更加绿色安全的豆芽生产安全保障技术提供了坚实的科学依据和优秀的菌种资源。未来，可以将这些菌株制成菌剂，通过种子包衣或添加到发芽用水中等方式应用于商业化豆芽生产。当然，在投入实际应用前，还需要对这些候选菌株进行全面的安全性评估（包括全基因组测序以排除毒素基因和耐药基因），并在真实的工业规模下验证其效果的稳定性和普适性（例如对抗不同血清型的大肠杆菌或沙门氏菌）。考虑到不同菌株的抗菌谱可能不同，未来很可能需要采用多菌株复配的“鸡尾酒疗法”来提供更广泛的保护。对拮抗机制更深入的解析也将助力其商业化应用。
