《Advanced Science》：Systematic Engineering of Proteases in Saccharopolyspora Spinosa Reveals Synergistic Enhancement of Spinosad Biosynthesis via Substrate Flux Optimization
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本研究通过大气室温等离子体（ARTP）诱变获得高产菌株D184，并结合蛋白酶组合工程、多组学分析与理性设计，系统阐明了蛋白酶介导的氮代谢调控网络。研究发现膜蛋白稳态（htpX）、ATP依赖蛋白水解（clpP）和氨基酸供应（pepP等）三个模块的协同作用可显著提升多杀菌素产量，在50L生物反应器中达到2318.87 mg/L，较野生型提高9.81倍。该工作为天然产物生物合成的蛋白酶调控机制提供了新见解。
引言
天然产物特别是次级代谢产物，是生物活性化合物的重要来源。多杀菌素作为由多粘孢子菌（Saccharopolyspora spinosa）产生的天然大环内酯类化合物，因高效、低毒和环境兼容性被广泛应用于农业害虫防治。虽然其生物合成途径已基本解析，但次级代谢与初级代谢途径间的动态平衡机制仍不明确。特别是前体供应、能量代谢和调控因子间的复杂相互作用尚未完全阐明，制约了通过理性代谢工程实现高效生物合成的进程。
材料与方法
菌株构建与培养：通过ARTP诱变技术对野生型多粘孢子菌进行突变处理，经高通量筛选获得突变株D184。利用表达载体pOJ260-PkasO*构建蛋白酶基因过表达工程菌，并通过CRISPRi技术进行基因敲低验证。
多杀菌素定量与生物活性检测：采用超高效液相色谱（UHPLC）测定发酵液中多杀菌素含量，并通过 Helicoverpa armigera 幼虫饲喂实验验证杀虫活性。
多组学分析：通过基因组重测序、数据非依赖采集（DIA）定量蛋白质组学和代谢组学技术，系统分析突变株与野生型的代谢差异。
协同效应分析：采用加和性相互作用指标计算基因组合的协同得分（s），当s≥1.15时判定为协同效应。
结果
ARTP诱变菌株D184的特性
D184在基础发酵培养基（BFM）和富氮培养基（YHM）中分别实现467.56 mg/L和775.55 mg/L的多杀菌素产量，较野生型提高5.11倍和3.28倍。扫描电镜显示D184菌丝更粗壮，生物量达到10.90 g/L。代谢分析表明其具有更高的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）水平和胞外蛋白水解能力。
蛋白酶靶标筛选与验证
从21个蛋白酶基因中筛选出8个高产靶点（dap、pepP、metAP、alp、clpP、htpX等），过表达菌株多杀菌素产量提升44.21%-51.27%。CRISPRi敲低实验证实这些蛋白酶对生物合成具有正向调控作用。
代谢网络重构
高产菌株表现出三方面代谢优势：
- 1.
胞外蛋白酶活性和蛋白水解能力增强
- 2.
酰基辅酶A前体库（malonyl-CoA、methylmalonyl-CoA）显著扩增
- 3.
能量载体ATP和NADPH水平同步提升
转录分析显示spn基因簇关键基因（spnB、spnC、spnE）表达上调，氨基酸代谢基因（ivd、cysK、thrC）协同激活。
跨模块协同效应
通过配对组合筛选发现，膜蛋白稳态模块（htpX）与氨基酸供应模块（dap）的组合效果最佳（1420.82 mg/L）。典型三角组合pepP-clpP-htpX在摇瓶发酵中产量达1507.60 mg/L，50L发酵罐中进一步提升至2318.87 mg/L。蛋白质组学分析表明该组合能协同上调氨基酸代谢、三羧酸循环（TCA）和脂肪酸β-氧化途径。
讨论
本研究首次在多粘孢子菌中建立了蛋白酶协同优化工作流程。研究发现蛋白酶通过调控氮代谢网络影响多杀菌素生物合成，其中ATP依赖蛋白酶ClpP与解折叠酶ClpX的平衡表达对维持蛋白稳态至关重要。跨模块协同（如pepP-clpP-htpX）通过优化前体供应、能量代谢和途径表达实现代谢通量重编程。未来研究应聚焦转录调控因子（如IclR家族）在蛋白酶介导代谢调控中的作用机制。
结论
通过ARTP诱变获得的高产菌株D184，结合蛋白酶系统工程与多组学分析，揭示了蛋白酶介导的氮代谢调控网络。研究发现膜蛋白稳态、ATP依赖蛋白水解和氨基酸供应三个模块的协同作用可显著提升多杀菌素产量。该研究为天然产物生物合成的蛋白酶调控机制提供了新视角，并为代谢工程提供了理性设计策略。
