基于磁性低共熔溶剂的涡旋辅助液液微萃取-紫外可见分光光度法快速检测食品饮料中4-甲基咪唑：一种多变量优化绿色分析方法

《Journal of Food Composition and Analysis》：Magnetic deep eutectic solvent-based vortex-assisted liquid liquid microextraction method for rapid determination of 4-methylimidazole in food and beverage matrices: Multivariate approach

本研究针对食品饮料中可能存在的潜在致癌物4-甲基咪唑(4-MeI)的检测难题，开发了一种新型磁性低共熔溶剂涡旋辅助液液微萃取(MDES-VA-LLME)结合UV-Vis检测的分析方法。研究人员通过Box-Behnken设计优化实验参数，建立了线性范围25-900 μg L-1、检测限7.4 μg L-1的高灵敏度检测方法，在多种实际样品中取得92.5-98.1%的加标回收率，为食品质量安全监测提供了快速、环保、低成本的分析解决方案。

　　

在食品工业中，焦糖色素作为最常用的食品着色剂，其使用量占所有食品着色剂的90%以上。然而，在氨法和氨-亚硫酸盐法焦糖色素的生产过程中，会不可避免地产生4-甲基咪唑(4-MeI)这种副产物。更令人担忧的是，4-MeI同样会通过氨与糖类的反应或美拉德反应在食品加工过程中自然形成。国际癌症研究机构(IARC)已将4-MeI归类为2B类可能人类致癌物，欧盟和国际食品添加剂联合专家委员会(JECFA)也因此对某些类别焦糖色素中的4-MeI含量设定了限量标准。面对这一食品安全隐患，开发准确、灵敏、高效的4-MeI检测方法显得尤为重要且紧迫。

传统的4-MeI检测技术，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等，虽然灵敏度较高，但通常需要昂贵的仪器、复杂的样品前处理（如衍生化步骤）和专业操作人员，限制了其在常规检测中的广泛应用。相比之下，紫外-可见分光光度法(UV-Vis spectrophotometry)因其仪器普及、操作简便、成本低廉而更具吸引力，但其直接检测复杂食品基质中的痕量4-MeI面临选择性和灵敏度不足的挑战。因此，发展高效、环保的样品前处理技术以实现4-MeI的分离富集，并与UV-Vis检测联用，是解决这一问题的有效策略。

在此背景下，发表于《Journal of Food Composition and Analysis》的一项研究提出了一种创新的分析方法。该研究团队开发了一种基于磁性低共熔溶剂(Magnetic Deep Eutectic Solvent, MDES)的涡旋辅助液液微萃取(Vortex-Assisted Liquid-Liquid Microextraction, VA-LLME)技术，用于快速萃取和富集食品饮料样品中的4-MeI，随后利用UV-Vis进行定量分析。

为开展此项研究，作者主要运用了几项关键技术：首先，制备了五种不同组分的磁性低共熔溶剂(MDES)并筛选其萃取效率；其次，利用4-MeI与金属离子（特别是Ca²⁺）的络合反应增强萃取选择性；第三，采用涡旋混合代替传统搅拌方式以加速传质过程；第四，利用强磁铁实现萃取相的快速、节能分离，省去了离心步骤；最后，运用Box-Behnken设计(BBD)这一实验设计方法对影响萃取效率的关键参数（如MDES体积、pH值、涡旋时间、Ca²⁺体积）进行系统优化，以最少的实验次数获得最佳操作条件。研究所用的实际样品（包括能量饮料、可乐、奶昔、焦糖风味冰咖啡、红糖、速溶咖啡、焦糖酱、可可粉、酱油、早餐谷物等）均购自土耳其锡瓦斯的本地市场。

3. 结果与讨论

3.1. 初步研究

研究人员首先通过初步实验确定了影响方法性能的关键因素。在五种备选的MDES中，由月桂酸、癸酸和MnCl₂以1:2:1摩尔比组成的MDES-2对4-MeI的萃取回收率最高（94.4%），这归因于其合适的极性和较低的粘度。在混合方式上，涡旋混合因其能提供更高的搅拌速度，增加目标物与溶剂分子的接触频率，从而获得比其他方式（超声、手动搅拌、空气辅助搅拌）更高的萃取效率。在用于与4-MeI络合的金属离子选择上，Ca²⁺离子表现出最高的回收率（94.6%），这符合硬软酸碱理论(HSAB)，即作为硬碱的氮原子（来自4-MeI的咪唑环）倾向于与硬酸Ca²⁺形成稳定络合物。

3.2. 化学计量学研究

采用Box-Behnken设计(BBD)对四个关键因素（MDES-2体积、pH值、涡旋时间、Ca(II)体积）进行三水平四因素优化。方差分析(ANOVA)表明所建立的二次模型极其显著(p < 0.0001)，且失拟项不显著(p = 0.3626)，说明模型预测值与实验值吻合良好。确定的最佳萃取条件为：MDES-2体积1.9 mL，pH 8.5，涡旋时间85秒，Ca(II)体积0.6 mL。在此条件下，预测萃取回收率为92.3%，验证实验结果为92.2%，证实了模型的可靠性。

3.3. 二元交互作用对回收率的影响

通过三维响应曲面图分析了因素间的二元交互作用。结果表明，在碱性条件(pH > 8)下，并使用较大体积的MDES-2(>1.7 mL)时，能获得较高的4-MeI回收率。MDES-2的体积是影响回收率的关键因素，而Ca(II)体积在低于1 mL时，在不同pH值下均能获得定量回收。

3.4. 方法验证

在最优条件下，对建立的MDES-VA-LLME方法进行了详细的方法学验证。该方法在25–900 μg L^-1浓度范围内呈现良好线性(R²= 0.9921)，检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为7.4 μg L^-1和25 μg L^-1。日内和日间精密度（以相对标准偏差RSD%计）分别介于1.2–1.8%和1.6–2.3%之间，表明方法重现性良好。在50 μg L^-1加标水平下，萃取回收率(ER%)为96.4%，富集因子(EF)高达133。基质效应研究表明，方法对可能共存的有机和无机干扰物具有高耐受性，显示出良好的选择性。

3.5. 实际样品测定与比较

将方法成功应用于10种实际食品饮料样品中4-MeI的测定。结果显示，4-MeI含量在可可粉中最低（6.8 ± 0.1 μg kg^-1），在焦糖风味冰咖啡中最高（142.7 ± 6.6 μg L^-1），速溶咖啡和早餐谷物中未检出。加标回收率在94.9%至102.1%之间，与参考方法（Altunay & Gürkan, 2019）的结果经t检验证实无显著性差异，证明了方法的准确性和可靠性。

3.6. 方法绿色度评估

采用分析绿色度评估指标(AGREE)对方法的绿色程度进行评价，该法基于绿色分析化学的12项原则。MDES-VA-LLME方法的AGREE得分为0.71（高于0.6的绿色方法阈值），表明其具有显著的绿色环保特性，这主要得益于使用低毒、可生物降解的MDES溶剂、避免使用有害有机溶剂、无需离心能耗以及较低的试剂消耗。

4. 结论

本研究成功开发了一种将磁性低共熔溶剂基涡旋辅助液液微萃取(MDES-VA-LLME)与紫外可见分光光度法联用的新策略，用于复杂食品和饮料基质中4-甲基咪唑(4-MeI)的快速、灵敏检测。该方法巧妙利用了MDES的磁性便于相分离、Ca²⁺络合增强选择性、涡旋辅助提高效率等优势，结合Box-Behnken实验设计优化，最终实现了优异的分析性能（低检测限、高回收率、良好精密度）和绿色环保特性。与已有报道的多种方法相比，本方法在保持高灵敏度的同时，兼具设备成本低、操作简便、环境友好等突出优点，为食品中4-MeI的常规监测和质量控制提供了一种高效、可靠且易于推广的分析工具，对保障食品安全和消费者健康具有重要意义。