《EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY》：Exercise intensity-dependent cardiac telocyte expansion is associated with physiological growth despite JAK/STAT pathway inactivity in male Wistar rats
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本文揭示了不同强度运动通过调控心脏端细胞（TCs）介导生理性心肌肥大的新机制。研究发现，高强度间歇训练（HIIT）和低强度间歇训练（LIIT）均能诱导生理性心脏生长和心肌细胞新生，且HIIT效果更显著。此过程伴随心脏TCs群体的强度依赖性扩张及心脏干细胞（CSCs）标志物GATA4表达上调。值得注意的是，尽管白细胞介素-6（IL-6）水平升高，但JAK/STAT通路核心组分（GP130、JAK2、STAT3）的转录水平未发生改变，提示存在非经典信号通路（如MAPK/PI3K）介导TCs与CSCs的通讯。该研究确立了TCs作为运动强度感应细胞在心脏适应性重塑中的核心地位，为优化心脏修复的运动处方提供了新靶点。
运动诱导生理性心脏生长的细胞机制探秘
引言
运动作为一种公认的强效刺激，能够促进生理性心脏生长，这一过程不仅涉及现有心肌细胞的肥大，还包括新心肌细胞的生成（即心肌细胞增生）。尽管传统观点将心脏适应主要归因于心肌细胞的增大，但新证据表明，运动还能激活心脏干细胞（CSCs）并导致新生心肌的形成。然而，运动触发CSC激活的确切细胞和分子机制仍未完全阐明。
心脏干细胞存在于被称为“微环境”或“巢”的特殊结构中，其命运受到与邻近细胞复杂相互作用的精细调控。端细胞（TCs）作为一种新近被识别的独特间质细胞类型，已成为这些巢的关键细胞组分。TCs以其极长且细的延伸结构（称为端足）为特征，在整个心脏中形成精细的三维网络。通过端足，TCs建立细胞间连接，并通过旁分泌细胞因子、外泌体和微RNA等方式参与维持组织稳态。
TCs在心脏生成巢中的战略性定位，突显了其作为CSCs“看护”细胞的潜在角色。越来越多的证据表明，TCs通过其分泌活动支持巢的稳态，并调控CSC的活性、增殖和分化。尤其相关的是，共培养研究证据显示，当TCs与CSCs共培养时，其分泌活性增强，而白细胞介素-6（IL-6）被确定为这种细胞通讯中的关键介质。这表明TCs分泌细胞因子（包括IL-6）可能是CSC激活的重要机制。
IL-6在TC介导的CSC激活中的潜在作用值得特别关注，因为这种肌肉因子在心血管系统中具有多重功能。尽管传统上被认为具有抗炎作用，但IL-6也能诱导心肌细胞产生肥大效应。先前的研究已表明IL-6在心肌损伤后干细胞介导的心脏修复中发挥作用。IL-6似乎通过与GP130受体结合并激活下游通路来发挥这些生物学效应。其中一条信号通路是Janus激酶（JAK）/信号转导与转录激活因子（STAT）级联反应，该通路通过增加STAT3靶基因的表达而与心脏肥大相关。
在骨骼肌生理学研究中，JAK/STAT通路在运动诱导的肥大中的作用已被确认，但其在生理性心脏生长中的功能仍不明确。先前在健康动物模型中的研究报道，运动训练增加了IL-6及相关细胞因子，同时降低了JAK2和STAT3的表达，这表明在心脏适应过程中，该通路存在复杂的调控机制。这种矛盾的反应凸显了需要进一步研究JAK/STAT通路在运动诱导心脏生长中的作用。
近期研究已开始探索心脏TCs对运动训练的反应，表明运动训练能增加心脏TCs群体，并且这种增加与CSC激活及生理性心脏生长相关。然而，关键的知识缺口依然存在。首先，TC对运动的反应是否具有强度依赖性尚属未知，尽管强度是已知能调节心脏适应性的关键参数。其次，在运动诱导心脏生长的背景下，TCs影响CSCs的具体分子机制尚未得到系统研究。因此，本研究旨在探究心脏TCs对间歇训练强度依赖性反应，并阐明JAK/STAT通路在TC介导的CSC激活中的潜在作用。
研究方法
伦理批准
所有实验程序均获得伊朗体育科学研究所研究伦理委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验室动物护理和使用指南》进行。
动物与实验设计
24只雄性Wistar大鼠（8周龄）被随机分为三组：对照组（CTRL）、高强度间歇训练组（HIIT）和低强度间歇训练组（LIIT），每组最初8只。动物在受控条件下饲养，在开始运动方案前适应实验室环境1周。
运动训练方案
运动方案基于已建立的大鼠训练模型设计，训练强度以最大摄氧量（V?O2max）的百分比设定。在8周的时间内，两个运动训练组每周完成5次跑步机训练（坡度为0°）。HIIT方案包括60分钟的训练课：5-10分钟热身（50-60% V?O2max），随后进行5组8分钟的高强度间歇跑（85-90% V?O2max），间歇期为2分钟主动恢复（50-60% V?O2max），最后进行5分钟整理活动。LIIT方案同样为60分钟：5-10分钟热身（45-50% V?O2max），随后进行5组8分钟的间歇跑（55-60% V?O2max），间歇期为2分钟主动恢复（45-50% V?O2max），最后进行5分钟整理活动。为确保方案依从性和动物福利，所有大鼠在主训练前均进行了为期1周的低速跑步机熟悉期。
组织采集
最后一次训练课后48小时，记录体重，麻醉动物后，快速取出心脏。称量全心重，计算心重/体重比。左心室组织样本迅速冻存用于分子分析，或用10%中性缓冲福尔马林固定用于组织学检查。对照组中有一个心脏因初始组织处理过程中的技术故障而被排除在后续分析之外，因此最终数据分析的组大小为CTRL组n=7，HIIT和LIIT组n=8。
苏木精-伊红（HE）染色
采用HE染色评估左心室壁厚度、心肌细胞面积和数量。对左心室壁厚度进行测量，并对心肌细胞横截面积和数值密度进行形态计量学分析。所有分析均由对实验分组不知情的两名研究者独立进行。
实时荧光定量PCR（qPCR）分析
检测左心室组织中IL-6、心肌营养素-1（CTF1）、GP130、JAK2、STAT3、GATA4以及ANP和BNP mRNA的表达水平。使用SYBR Green染料法在实时荧光定量PCR仪上进行检测。基因表达水平以内参基因GAPDH进行标准化，采用2–ΔΔCq方法计算相对表达量。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
使用商业大鼠IL-6 ELISA试剂盒定量心脏组织匀浆液中的IL-6蛋白水平。
免疫荧光染色
采用免疫荧光双标法鉴定心脏TCs和心肌细胞。TCs通过CD34与血小板衍生生长因子受体（PDGFR）-α以及CD34与PDGFRβ双阳性标记物进行检测；心肌细胞通过α-肌动蛋白抗体进行鉴定。对CD34–PDGFRα和CD34–PDGFRβ双阳性细胞进行计数以量化TCs。所有定量均由对实验分组不知情的研究者进行。
统计学分析
数据以均值±标准差表示。使用SPSS软件进行统计分析。采用单因素方差分析比较三组间的差异，当存在显著主效应时，使用Tukey's HSD检验进行事后比较。显著性水平设定为P ≤ 0.05。
研究结果
运动诱导的心脏生长与分子变化
运动训练显著影响心脏生长参数。心重/体重比在各组间存在显著差异。事后分析表明，与对照组相比，HIIT组和LIIT组的HW/BW比均显著升高。左心室壁厚度也表现出显著的强度依赖性增厚。与对照组相比，HIIT组和LIIT组均显示显著增加，且HIIT引起的肥厚反应比LIIT更显著。
心肌细胞大小分析显示，各组间横截面积显著增加。两个运动训练组与对照组相比均显示心肌细胞显著增大，且HIIT诱导的心肌细胞增大程度大于LIIT。总心肌细胞数量在两个运动训练组中均显著升高，与对照组相比，HIIT组和LIIT组均显著增加，且HIIT刺激的增加幅度大于LIIT。
α-肌动蛋白阳性细胞密度的定量分析揭示了运动训练的显著效应。事后分析表明，与对照组相比，LIIT和HIIT均诱导α-肌动蛋白阳性细胞密度显著增加。此外，HIIT在增加α-肌动蛋白阳性细胞密度方面显著优于LIIT。
相比之下，病理性重塑标志物ANP和BNP的mRNA水平在两种训练方案后均未发生变化，证实了运动诱导心脏生长的生理性质。
JAK/STAT信号通路评估
接下来评估了JAK/STAT通路（IL-6家族细胞因子的经典下游信号级联）在运动诱导心脏生长中的潜在激活情况。对JAK/STAT通路配体的分析揭示了一种独特的模式。心脏IL-6基因表达在各组间存在显著差异，与对照组相比，HIIT组显著上调。CTF1基因表达未发生显著改变。与基因表达数据一致，心脏IL-6蛋白水平在HIIT组和LIIT组中均较对照组显著升高。
尽管上游配体水平升高，但JAK/STAT通路的核心组分在转录水平上保持未改变。在各实验组间，未观察到GP130、JAK2或STAT3基因表达存在显著差异。这种配体可用性增加与其经典信号通路激活缺失之间的解耦，表明经典JAK/STAT级联反应在此条件下不太可能是主要介质。
运动训练以强度依赖性方式增加心脏TC群体
为了探究TCs在运动诱导心脏生长中的潜在作用，我们使用免疫荧光双标法对左心室中TCs的丰度进行了定量。两种运动训练方案均显著扩增了心脏TC群体。值得注意的是，这种运动诱导的TC丰度增加具有强度依赖性。定量分析显示，与LIIT方案相比，HIIT导致CD34–PDGFRα阳性和CD34–PDGFRβ阳性细胞数量显著更多。
运动强度增强GATA4表达（心脏干细胞激活的标志物）
与观察到的端细胞扩张和心肌细胞新生一致，我们发现GATA4（心脏干细胞分化的关键转录因子）显著上调。GATA4基因表达在各组间显示显著上调。两个运动训练组与对照组相比均表现出心脏GATA4表达升高。
讨论
本研究揭示了一个新颖的、强度依赖性的轴心，该轴心以心脏TCs的扩张及其对驻留干细胞的非经典信号传导为中心，调控生理性心脏生长。我们证明高强度和低强度间歇训练均能强劲促进生理性肥厚和心肌细胞新生，而适应的幅度——包括TCs的增殖和干细胞分化标志物GATA4的上调——在HIIT后显著更大。关键的是，我们首次提出证据表明，这种TC介导的适应过程是在JAK/STAT信号通路不参与的情况下运行的，尽管心脏IL-6水平同时升高，从而挑战了关于IL-6在运动诱导心脏重塑中作用的经典观点，并提出了一个新的机制范式。
我们的数据牢固地确立了心脏TCs是运动心脏中动态的、强度敏感的细胞组分。虽然先前的研究注意到运动训练后TCs扩张，但明确的剂量反应关系仍未确定。在这里，我们证明HIIT诱导的CD34–PDGFRα/β阳性TCs的增加显著大于LIIT。基础研究已引入TCs作为干细胞巢内的动态传感器。本研究的结果通过证明心脏端细胞群体的强度依赖性增加，提供了直接证据表明这些细胞主动感知运动衍生的刺激，并且它们的反应与运动强度直接校准。平行的、强度分级的GATA4（心脏发生的主要调节因子）上调，提供了令人信服的关联证据，表明扩张的TC网络促进了更强劲的CSCs激活和分化。这种时间上的耦合表明TCs不仅仅是旁观者，而是有利于运动诱导心肌细胞生成的巢的积极构建者。这与TCs作为干细胞巢内“看护”细胞的作用是一致的，这一功能先前在心脏再生背景中已被观察到。我们的研究扩展了Xiao等人和Choobineh等人的工作，他们报道运动可增加心脏TCs，我们的研究通过定量地将TC扩张的程度与运动强度联系起来，并证明其在HIIT下的优越效果。
我们最初假设JAK/STAT通路是TC-CSC通讯的核心，鉴于其在IL-6信号传导和肥厚中的既定作用。然而，我们的结果揭示了一个关键的解耦现象：心脏IL-6蛋白的强劲增加伴随着核心JAK/STAT机制在转录水平上的静止。这一发现与Chen等人的工作一致并扩展了该工作，他们观察到健康运动大鼠中JAK/STAT下调，通过证明该通路在显著扩张的TC群体背景下无活性。这表明JAK/STAT通路的作用可能是情境依赖性的，主要在病理性重塑或疾病状态期间被激活，如在运动后疾病模型中的激活所表明的那样，但在健康心肌的生理性生长过程中是非必需的或被抑制的。这一发现似乎与运动后骨骼肌中JAK/STAT激活的报道相矛盾。这种差异强调了运动信号传导的组织特异性。此外，除了组织差异之外，在JAK/STAT通常过度激活的病理性心脏模型中，运动可以使其活性正常化。我们从健康心脏获得的数据表明，在纯粹的生理适应背景下，JAK/STAT通路可能不是必需的，指出了生理性和病理性生长之间信号拓扑的根本差异。
这一悖论需要机制上的重新解释。我们提出，运动诱导的IL-6——可能由TCs自身分泌——通过替代的、非经典的途径（如MAPK/PI3K通路）和囊泡介导的通讯向驻留干细胞发出信号，以影响CSCs。此外，TCs可能采用多方面的通讯策略，而不仅仅是细胞因子分泌。通过端足的直接细胞间通讯以及通过外泌体靶向递送调节性微RNA和生长因子，代表了值得未来研究的引人注目的替代机制。我们的研究将焦点从单一通路转向了基于网络的TC介导调控模型。
我们对强度依赖性TC扩张的发现并非孤立现象，而是一种基本适应原则的表现。骨骼肌中的工作有力地证实了这一点，Ravalli等人证明TCs是组织对使用和废用反应的动态组成部分，耐力训练可防止其在 inactivity 期间下降。这种跨组织的一致性强调了TCs是运动适应性细胞巢的一个保守的调节组分。关键的是，这种扩张在心脏中的功能后果很可能是创建了一个促再生的微环境。病理模型中的干预研究有力地支持了这一点，在心肌梗死后直接移植TCs显著增强了心脏恢复。我们的数据表明这种扩张可由运动自然诱导，并与GATA4表达增加相关联，为这些治疗观察提供了生理学和机制上的桥梁。扩张的TC群体不仅仅是存在；它是功能活跃的，培育着一个支持干细胞向心肌生成命运分化的巢。
这一经过提炼的理解，将TC和TC-CSC轴定位为心血管再生的核心治疗靶点，具有直接而深远的临床意义。我们的数据为超越关于运动方式的传统辩论提供了坚实的生理学依据。相反，它们突显了运动强度作为细胞巢适应的关键决定因素。利用这种TC扩张的强度剂量可以指导新的康复策略，主张在预防和治疗背景下处方HIIT以最大化心脏修复和健康益处。
虽然我们的发现为优化运动强度以增强心脏再生提供了生理学依据，但应考虑某些局限性。这种解释的一个关键局限性是它仅基于基因表达数据。我们不能排除在单一训练后时间点未捕获到的JAK/STAT蛋白水平或磷酸化状态的瞬时变化的可能性。此外，虽然我们的样本量与大鼠运动研究相当，但检测基因表达中细微变化的统计功效可能有限。未来纳入更大群体的研究将有助于确认这些观察结果。未来结合磷酸化蛋白分析的研究对于最终确定该通路在运动诱导生理性肥厚中的活性状态至关重要。此外，TC来源的外泌体的精确分子货物以及接收这些信号的CSCs上的特定受体仍有待阐明。然而，这些局限性并未削弱我们的核心发现，而是为未来的研究指明了清晰的方向。
结论
总之，我们的研究确立了心脏TCs作为运动强度感应调节因子，调控生理性心脏生长。我们证明运动强度按比例扩张TC网络，这与增强的心脏干细胞激活和心肌细胞新生相关。关键的是，尽管IL-6水平升高，但这种TC介导的适应发生在核心JAK/STAT组分转录上调缺失的情况下，指向替代机制，如MAPK/PI3K通路和囊泡介导的通讯。然而，该通路在蛋白质水平的活性状态需要进一步研究以最终排除其参与。这些发现为在预防和再生策略中优化运动强度提供了生理学基础，同时强调了界定TC-CSC串扰的精确分子介质的必要性。
