《Journal of Future Foods》：Exploration of the Influences of Various Coagulants on Multi-Dimensional Quality Indices During the Pre-Fermentation Stage of Sufu
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本研究针对不同凝固剂（发酵黄浆水FSW、葡萄糖酸-δ-内酯GDL、石膏GYP）如何调控腐乳前发酵阶段凝胶特性、风味形成及生物胺积累等关键科学问题，系统揭示了凝固剂类型通过影响蛋白质网络结构、微生物代谢途径及理化微环境，进而多维调控腐乳品质的分子机制。研究结果为定向优化腐乳生产工艺、提升产品感官品质与食用安全性提供了重要理论依据和实践指导。
腐乳，这款被誉为“中国奶酪”的传统发酵豆制品，拥有超过1800年的悠久历史，以其独特风味、丰富营养和高消化吸收率而备受青睐。它不仅是一种美味食品，更被研究发现具有抗氧化、抗衰老、降血压、降血脂乃至抑制肿瘤生长等多种生理功效。然而，在腐乳生产的漫长链条中，一个关键步骤——豆浆的凝固成坯，却深刻影响着最终产品的命运。凝固剂的选择，如同点豆腐的“点睛之笔”，直接决定了豆腐坯的物理化学特性，进而影响后续发酵过程的走向和最终腐乳的得率、质构、风味乃至安全性。当前，尽管已有研究关注腐乳的凝胶特性或最终产品风味，但对于连接初始凝固与最终发酵的“前发酵”这一关键桥梁阶段，不同凝固剂如何动态影响豆腐坯基质的演化，其内在机制尚缺乏系统深入的探究。
为了揭开这一迷雾，云南农业大学食品科学技术学院的研究团队在《Journal of Future Foods》上发表了一项研究，他们选取了三种常见的凝固剂——石膏（GYP）、葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）和发酵黄浆水（FSW），制备了不同性质的豆腐坯，并在随后接种毛霉进行前发酵。研究团队像侦探一样，系统追踪了发酵过程中豆腐坯在质地特性、水分迁移、微观结构网络形成、蛋白质水解、脂肪酸组成、生物胺含量以及挥发性风味物质等方面的动态变化图谱，旨在阐明不同凝固剂对前发酵阶段腐乳凝胶特性、微观结构和风味物质的塑造作用，为腐乳产品的定向调控与品质优化提供理论基石。
研究人员运用了一套组合拳般的技术方法。他们系统监测了前发酵过程中样品的理化指标（如水分、pH、总酸、氨基酸态氮、水溶性蛋白）。通过质构分析（TPA）评估凝胶的硬度、粘附性、弹性等；利用Zeta电位分析凝胶稳定性；通过表面疏水性和游离巯基含量分析蛋白质构象变化；采用流变学分析揭示凝胶的粘弹性行为；借助傅里叶变换红外光谱（FTIR）解析蛋白质二级结构的演变；扫描电子显微镜（SEM）则直观展现了凝胶微观结构的动态演化。此外，研究还精密分析了短链、中链和长链脂肪酸的组成与变化，检测了多种生物胺（如组胺、酪胺、尸胺、精胺等）的含量动态，并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）技术全面剖析了挥发性风味物质的组成与差异。
3.1. 前发酵期间不同凝固剂制备腐乳的理化指标分析
研究发现，水分含量在前发酵期（0-24小时）呈上升趋势，FSW样品水分含量最高（83.19%），这可能与微生物蛋白酶更快破坏原始豆腐凝胶网络有关。随后，由于蛋白质网络重组，水分逐渐渗出。pH值变化趋势相似，均先降后升，GDL样品pH始终较低，FSW样品最终pH最高（7.34）。总酸度在整个过程中持续增加，FSW样品显著高于其他两组，达到0.54 g/100g，这主要源于微生物代谢产生的有机酸。氨基酸态氮（AAN）含量在前发酵早期持续上升，FSW样品始终维持较高浓度，反映了蛋白质被水解为氨基酸和肽的过程。水溶性蛋白（WSP）含量总体也呈增加趋势，与微生物分泌蛋白酶降解蛋白质密切相关。
3.2. 不同凝固剂制备腐乳前发酵期间凝胶特性分析
3.2.1. 质构分析
三种豆腐凝胶的硬度均呈现先下降后上升的趋势，但峰值出现时间和数值差异显著。FSW样品在96小时硬度达到峰值（0.93 N），而GYP和GDL样品则在72小时达到峰值（分别为1.56 N和1.80 N），随后在96小时下降，表明凝胶随发酵进行变软。粘附性先增后减，弹性方面，FSW的弹性增加，而GYP和GDL则下降。咀嚼性结果中，FSW持续增加，另两种则变化不同，提示微生物活动影响了凝胶网络结构。FSW样品呈现出柔软、糯滑的质地特性。
3.2.2. Zeta电位分析
Zeta电位绝对值越大，表明体系稳定性越高。GDL样品的Zeta电位绝对值在发酵过程中显著增加，72小时和96小时值相近（约33 mV），显著高于GYP和FSW样品。GYP样品因Ca2?中和部分蛋白质表面负电荷，其Zeta电位绝对值普遍较低。尽管GDL组Zeta电位最高，但宏观凝胶稳定性最佳的是FSW组，说明凝胶稳定性并非仅由静电斥力决定，疏水相互作用、氢键等非共价力以及酸化速率也至关重要。
3.2.3. 表面疏水性与游离巯基含量分析
表面疏水性在三组样品中均呈现先下降后上升的趋势。发酵初期表面疏水性下降可能与净负电荷增加形成水化层、或发酵形成聚集体包埋疏水氨基酸有关。游离巯基含量总体增加，可能与蛋白质降解暴露内部SH基团或二硫键，以及发酵导致蛋白质变性暴露游离巯基有关，这些巯基可氧化形成二硫键，促进分子间交联。
3.2.4. 流变学分析
所有样品粘度均随剪切速率增加而下降，表现为剪切稀化行为。FSW样品粘度在整个发酵期间维持在较高水平，GDL和GDL样品粘度则随剪切率增加急剧下降。这表明凝胶内部存在氢键等相互作用形成的结构，剪切力使其破坏。
3.2.5. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
FTIR光谱显示，三组腐乳凝胶的谱图基本一致，主要吸收峰包括酰胺I带、酰胺II带、C-H伸缩振动以及O-H和N-H伸缩振动（提示氢键存在）。基本官能团组成在发酵过程中保持稳定，但酰胺I和酰胺II带的特征吸收显著减弱或难以检测，提示凝胶结构的维持可能不主要依赖这些基团形成的氢键或共价键，而可能更依赖于其他类型的分子间作用力。蛋白质二级结构分析表明，发酵处理显著影响β-折叠和α-螺旋含量，导致蛋白质分子重排。
3.2.6. 微观结构分析
扫描电镜（SEM）观察显示，不同凝固剂和发酵时间点，凝胶表面形态差异显著。GYP样品在0小时表面粗糙有不规则突起，发酵24小时孔洞变大、变深、更无序；随后向类晶体形态转变。FSW样品在发酵初期表面有大量不规则气泡状结构，与其中微生物产气有关；发酵至72小时，表面出现细小有序排列的气泡。GDL样品微观结构变化与FSW相似，但空腔形成时间相对滞后。GYP样品初始的孔隙结构与其水化形成的晶体网络骨架有关。
3.3. 不同凝固剂制备腐乳前发酵期间脂肪酸含量分析
3.3.1. 短链脂肪酸分析
乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸和戊酸在所有样品中均被检出。FSW样品未检出异戊酸和己酸，但独特含有异丁酸。总短链脂肪酸含量在0小时最高。
3.3.2. 中长链脂肪酸分析
共检出19种中长链脂肪酸。GDL和GYP样品所含中长链脂肪酸种类相同，而FSW样品独特含有C8:0（辛酸）和C24:0（二十四烷酸）。C16:0（棕榈酸）和顺-9 C18:1（油酸）的含量高于其他脂肪酸。FSW中独特的脂肪酸可能与其中微生物的特有代谢途径有关。
3.4. 不同凝固剂制备腐乳前发酵期间生物胺含量分析
生物胺是微生物脱羧游离氨基酸的产物。GYP和GDL样品中检出7种生物胺（色胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、精胺、尸胺、亚精胺），未检出组胺，表明豆腐在此阶段品质良好。FSW样品检出8种生物胺，其组胺含量在发酵过程中持续下降（3.62至1.01 mg/kg），表明FSW中存在组胺产生菌，但其活性或底物在发酵中被消耗。亚精胺含量在FSW中显著下降，而腐胺呈上升趋势。总生物胺含量在GDL和GYP样品中显著降低，可能与石膏改变组织结构抑制腐败菌，或GDL代谢产酸抑制微生物有关。
3.5. 不同凝固剂制备腐乳前发酵期间挥发性风味成分分析
韦恩图显示，三组样品在前发酵期腐乳风味谱中检测到39种相同风味化合物。FSW样品含65种风味化合物，其中有13种独特成分，如乙丙酯、2,3-戊二酮、1-戊烯-3-醇、己酸乙酯、糠醛等。GYP样品含65种风味化合物，有7种独特物质，如丁酸甲酯、异戊酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪（具坚果、烘烤香气）等。GDL样品含56种风味化合物，有5种独特物质，如3-甲基戊酸、4-甲基戊酸（具干酪味）等。含量积累图显示，乙酸乙酯、2-丁酮、乙醇等39种共有组分在发酵0-96小时含量变化明显。风味物质主要分为醇、酚、酸、酮、醛、酯、呋喃、吲哚等十多类。聚类分析表明发酵时间对风味物质有显著影响。
3.6. 不同凝固剂前发酵过程中多指标相关性分析
通过皮尔逊相关性分析发现，在FSW样品中，糠醛与长链脂肪酸显著正相关；水分含量与多数风味化合物正相关；质地参数与水溶性蛋白显著正相关。在GDL样品中，硬度、咀嚼性与C18:0呈负相关；水分含量与多数挥发性成分负相关。在GYP样品中，2-甲基吡啶与长链脂肪酸显著负相关；水溶性蛋白与风味物质正相关；质地与脂肪酸负相关。这些相关性揭示了理化指标、质地、风味物质和脂肪酸之间的内在联系。
3.7. 腐乳凝胶形成机制
基于以上发现，研究提出了前发酵期间豆腐凝胶结构演变的示意图。不同凝固剂影响豆腐形态。FSW凝固的豆腐表面相对粗糙，且其蛋白质二级结构中缺乏β-转角。在FSW前发酵过程中，水分含量下降，表面疏水性降低，而游离巯基含量和Zeta电位增加。FSW作为凝固剂的机制主要归因于其酸性成分降低pH至蛋白质等电点附近，同时酸性环境加热诱导蛋白质变性，通过疏水相互作用、氢键和二硫键形成三维网络。由于FSW中含有小分子物质，其样品的理化性质、质构、蛋白质结构、脂肪酸谱和风味特征与GYP和GDL样品差异显著。
4. 结论
本研究系统阐明了三种凝固剂对腐乳前发酵阶段品质形成的差异化调控机制。凝固剂类型显著影响腐乳的生物胺谱、凝胶流变性、微观结构演化、脂肪酸组成及挥发性风味物质谱。FSW因其复杂的微生物体系引入了独特的风味前体和代谢途径，赋予了产品更丰富的风味层次，但也需关注其生物胺（如组胺）的控制。GDL和GYP则在不同方面展现了其调控优势。这些发现为针对不同品质需求（如风味复杂性、质地硬度、安全性）科学选择凝固剂提供了理论依据和实践指导，对提升传统发酵豆制品的品质可控性与安全性具有重要意义。
