《Journal of Functional Foods》：Anticancer effects of
Chlorella sorokiniana Shihira and R. W. Krauss extract via Bcl-2/Bax modulation and AMPK-α activation in hepatoma cells
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本研究针对肝癌治疗中传统化疗药物副作用大、缺乏选择性诱导癌细胞凋亡有效天然化合物的问题，探讨了淡水微藻Chlorella sorokiniana提取物（CSE）的抗癌潜力。研究发现CSE通过上调Bax、AMPK-α、caspase-3和下调Bcl-2、VEGF表达，显著诱导p53缺陷型Hep3B细胞凋亡，且对正常肝细胞毒性较低，为肝癌靶向治疗提供了新型天然药物候选材料。
在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一，其中肝细胞癌（HCC）占肝癌死亡的绝大多数。尽管手术、化疗、放疗和靶向治疗等多种治疗手段已被开发用于管理HCC，但治疗效果仍不理想，患者预后较差。尤其值得关注的是，p53肿瘤抑制基因的突变或缺失在HCC中极为常见，这些遗传改变会损害细胞修复DNA和启动凋亡的能力，与治疗反应差和疾病快速进展相关。因此，寻找能够选择性诱导癌细胞凋亡且副作用小的天然化合物成为当前研究的热点。
微藻作为一类高效的自养生物，能够比陆生植物更快地合成生物活性化合物。它们产生的多酚、类胡萝卜素、叶绿素等物质具有强大的抗氧化活性，能够抑制氧化应激（癌症的关键触发因素）并抑制肿瘤生长。然而，关于淡水微藻Chlorella sorokiniana次级代谢产物对凋亡相关通路，特别是在p53缺陷型肝癌细胞中的调节作用，目前尚不清楚。
为了填补这一空白，发表在《Journal of Functional Foods》上的这项研究，旨在从C. sorokiniana中提取生物活性物质，评估其抗氧化活性及抗癌效果，并深入探究其通过AMPK-α激活和Bcl-2/Bax调控诱导p53缺陷型肝癌细胞凋亡的分子机制。
研究人员采用超声波辅助提取技术从C. sorokiniana中获取提取物（CSE），并系统评估了其总多酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、叶绿素含量以及自由基清除活性（DPPH和ABTS法）。利用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对CSE中的主要次级代谢产物进行了定性和定量分析。在细胞水平，研究选用p53野生型的HepG2细胞和p53缺陷型的Hep3B细胞作为模型，通过MTT法检测细胞活性，划痕实验评估细胞迁移能力，流式细胞术（Annexin V/PI染色）分析细胞凋亡和坏死，半定量RT-PCR和蛋白质印迹法（Western blot）检测凋亡相关基因（Bcl-2, Bax, AMPK-α, caspase-3, VEGF）和蛋白的表达水平，并通过免疫荧光染色观察细胞形态、细胞间连接（ZO-1）和细胞骨架（F-actin）的变化。
3.1. 多酚、黄酮和叶绿素含量的评估
研究发现，CSE具有较高的总多酚含量（4.49 mg GAE/g DM）和总黄酮含量（0.86 mg QE/g DM），以及显著的叶绿素a（2.81 mg/g DM）和叶绿素b（1.77 mg/g DM）含量，表明其富含抗氧化成分，潜力优于多种陆生植物。
3.2. 抗氧化活性评估
通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估CSE的抗氧化潜力。CSE在ABTS assay中表现出较强的自由基清除活性（45.01%），显著高于DPPH assay（9.16%），表明其抗氧化能力主要归因于亲水性抗氧化成分。
3.3. 通过HPLC鉴定主要色素
HPLC分析确定叶黄素（lutein）是CSE中的主要色素成分之一，定量浓度为0.14 mg/g DM。叶黄素以其抗氧化和抗炎特性著称，可能对CSE的抗癌效应有重要贡献。
3.4. 通过HPLC和LC-MS/MS鉴定主要多酚
LC-MS/MS分析进一步鉴定出CSE中的关键多酚类物质为异鼠李素（isorhamnetin）、山奈酚（kaempferol）和甘草素（liquiritigenin）。这些化合物已知具有调控凋亡通路、诱导细胞周期阻滞和抑制癌细胞增殖的作用。
3.5. 癌细胞活性评估
细胞活性实验表明，CSE能浓度依赖性地抑制p53缺陷型Hep3B细胞的活力，而对p53野生型HepG2细胞的毒性较小。在0.5 mg/mL浓度下，Hep3B细胞活力降至77.9%，而HepG2细胞仍保持86.9%的活力，显示了CSE对p53缺陷型癌细胞的选择性毒性。
3.6. 肝癌细胞迁移评估
划痕实验结果显示，CSE能显著抑制p53缺陷型Hep3B细胞的迁移能力，且这种抑制作用呈浓度依赖性。在30.0 μg/mL浓度下，Hep3B细胞的迁移闭合率降至28.4%，而HepG2细胞的迁移受影响较小。单独使用叶黄素也观察到了类似的选择性迁移抑制效果。
3.7. 凋亡相关基因表达评估
基因表达分析显示，CSE处理能显著上调Hep3B细胞中促凋亡基因Bax和AMPK-α的表达，下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而导致Bcl-2/Bax比值降低。同时，CSE还上调了凋亡执行者caspase-3的表达，并下调了血管生成相关因子VEGF的表达。单独叶黄素处理也显示出类似的趋势，但CSE的整体效果更强，提示其抗癌作用是多种活性成分协同作用的结果。
3.8. 凋亡相关蛋白表达评估
蛋白质水平分析进一步证实了基因表达的结果。CSE处理显著增加了Bax、AMPK-α和caspase-3的蛋白表达，降低了Bcl-2和VEGF的蛋白表达，导致Bax/Bcl-2比值显著升高，强化了其促凋亡和抗血管生成的效应。
3.9. 凋亡和坏死评估
流式细胞术分析（Annexin V/PI染色）明确显示，CSE能选择性诱导p53缺陷型Hep3B细胞发生凋亡，而对p53野生型HepG2细胞的影响很小。在Hep3B细胞中，CSE处理导致早期和晚期凋亡细胞比例显著增加，细胞存活率明显下降。
3.10. 形态学改变和细胞-细胞连接稳定性的评估
免疫荧光染色结果显示，CSE处理导致p53缺陷型Hep3B细胞出现核浓缩和碎裂（凋亡特征），细胞间连接蛋白ZO-1表达减少和分布紊乱，以及细胞骨架F-actin结构破坏。而p53野生型HepG2细胞在这些方面则保持相对完整，进一步证明了CSE对p53缺陷型癌细胞的选择性作用。
本研究得出结论，淡水微藻Chlorella sorokiniana提取物（CSE）富含叶黄素、异鼠李素、山奈酚和甘草素等多种生物活性成分，展现出显著的抗氧化活性。更重要的是，CSE能通过激活AMPK-α信号通路，调控Bcl-2/Bax比值，激活caspase-3，并抑制VEGF表达，从而选择性诱导p53缺陷型肝癌细胞（Hep3B）凋亡、抑制其迁移，而对p53野生型肝细胞（HepG2）影响较小。这种选择性毒性可能与p53缺陷细胞在应激条件下存活信号通路受损有关。
该研究的重要意义在于首次系统地揭示了C. sorokiniana提取物通过AMPK-α/Bax轴诱导p53缺陷型肝癌细胞凋亡的分子机制，为开发针对p53突变（常见于晚期和治疗抵抗性肝癌）的靶向天然抗癌药物提供了重要的理论依据和实验证据。CSE作为一种来源丰富、可持续的天然产物，在肝癌的预防和辅助治疗方面展现出良好的应用前景。未来研究可集中于CSE的标准化制备、活性成分的协同作用机制以及其在动物模型和临床研究中的进一步验证。
