《Journal of Physiology》：Elevational variation in heart mass and suppression of hypoxia-induced right ventricle hypertrophy in Andean leaf-eared mice (Phyllotis)
编辑推荐：
本综述深入探讨了安第斯叶耳鼠（Phyllotis）适应高海拔缺氧环境的核心生理机制。研究发现，与低地哺乳动物不同，这些高山土著物种通过协调性心脏增大（而非单纯的右心室（RV）肥大）来应对慢性缺氧，有效抑制了低氧性肺动脉高压（HPH）及其引发的右心室肥大。转录组分析进一步揭示了与横纹肌结构、免疫过程和炎症反应相关的关键调控基因（如Jph2）在抑制RV肥大中的重要作用，为理解脊椎动物高海拔适应提供了新的分子视角。
引言
理论表明，对新环境的殖民和对分布区边缘边际栖息地的适应，可以直接或间接地由适应性表型可塑性所促进。然而，在某些情况下，环境诱导的表型变化可能在新栖息地中代价高昂或产生反效果，从而阻碍局部适应。在低地哺乳动物上升到高海拔经历环境缺氧时，适应不良的可塑性例子已被充分记录。适应不良的可塑性可能发生在那些祖先从未遭遇过由大气氧分压（PO2）降低最终导致动脉低氧血症和组织缺氧情况的低地物种中。在这种情况下，对细胞氧减少的感知可能被误解为与肺氧交换或对流性氧运输相关的问题。适应不良可塑性的一个特别好的例子涉及缺氧诱导的肺循环变化。
在生活在海平面的哺乳动物中，肺动脉血管会对低氧产生收缩反应，从而将血流重新引导至肺部通气较好、非缺氧的区域。当肺部存在区域性的氧水平差异时，这种通气和灌注的动态匹配提高了肺气体交换的效率。然而，在上升到高海拔时，由于吸入空气的PO2降低，整个肺部的氧气可用性都降低了。在这种情况下，会发生全局性的肺血管收缩反应，并且在暴露于缺氧的24-48小时内，诱导的肺血管重构可导致动脉平滑肌增厚。血管收缩和血管重构的共同作用降低了肺血管的扩张性并增加了血管阻力，这可导致肺动脉压急剧升高。这种低氧性肺动脉高压（HPH）会危险地增加右心室后负荷（右心室（RV）收缩以将血液从心脏射出所需要对抗的压力），导致右心室肥大并增加心力衰竭的风险。肺毛细血管中静水压的增加也可能导致一种众所周知的疾病，即高原肺水肿。
在全球性缺氧的高海拔环境中，HPH可能因红细胞生成过度增加（红细胞增多症）而加剧，这是低地哺乳动物对缺氧暴露的典型反应。虽然红细胞数量的增加提高了血液的携氧能力，但过度的红细胞增多症如果没有伴随血容量的相应扩张，就会增加血液粘度，从而导致肺血管阻力的进一步增加。
一些原生於高海拔环境的哺乳动物似乎已经进化出减弱HPH的方法，这说明缺氧适应可能常常涉及对适应不良的习服反应的遗传补偿。例如，对鹿鼠（Peromyscus maniculatus）进行的长期驯化实验（高海拔和低海拔原生个体在相当于4300米的慢性缺氧条件下驯化6-8周）表明，与同等驯化的低海拔同种个体相比，高海拔鹿鼠表现出不那么明显的HPH，并且不出现右心室肥大或肺动脉增厚。高海拔原生个体在慢性缺氧下能维持正常的通气-灌注匹配，而低海拔同种个体则不能，并且在缺氧条件下表现出更优的有氧运动能力。这些发现表明，原生於高海拔环境的小鼠已经进化出减弱缺氧驯化的某些适应不良效应的方法。
叶耳鼠属（Phyllotis）广泛分布于南美洲的安第斯山脉及毗邻的阿尔蒂普拉诺高原，有几个物种沿着安第斯山脉两侧具有异常广阔的海拔分布。例如，安第斯叶耳鼠（Phyllotis vaccarum）已被记录出现在安第斯山脉中部一些最高山峰的顶峰，海拔超过6700米。在安第斯山脉西坡，该物种的海拔分布下限一直延伸到智利北部的沙漠海岸线。 across the same elevational gradient, several other species of Phyllotis have distributions that extend from the Atacama Desert to Andean dry puna habitats at elevations between ～3500 m and 5500 m.
本文研究了在安第斯山脉西坡一个陡峭的海拔梯度上广泛共分布的四种亲缘关系密切的叶耳鼠的体重、心脏质量、右心室肥大指标和血液血红蛋白浓度（[Hb]）的海拔变异。这四种物种，智利叶耳鼠（Phyllotis chilensis）、利马叶耳鼠（Phyllotis limatus）、马吉斯特叶耳鼠（Phyllotis magister）和安第斯叶耳鼠（P. vaccarum），在安第斯山脉西坡具有部分重叠的海拔分布范围，其上界均超过3500米。我们评估了心脏质量的海拔变化在多大程度上是由右心室肥大驱动的，并检验了像安第斯叶耳鼠这样的特高海拔土著物种是否表现出与其他叶耳鼠物种定性或定量上不同的变异模式。为了深入了解抑制右心室肥大的可能转录机制，我们还检查了来自两个地理上 distinct 的高海拔种群（均来自海拔>5000米）的安第斯叶耳鼠右心室的转录组变异模式。
方法
伦理批准
所有活体捕获的动物均按照内布拉斯加大学机构动物护理和使用委员会（项目ID：1919和2100）以及智利南方大学生物伦理委员会（证书456/2022）批准的方案进行处理。
采样设计
在2020年至2022年期间，于智利北部和玻利维亚西部的阿塔卡马沙漠和安第斯干普纳进行的小型哺乳动物调查过程中，我们在跨越广泛海拔范围的各种生境地点诱捕了叶耳鼠，从接近海平面到超过6700米的火山顶峰。
活体诱捕和标本制备
我们使用Sherman活捕器捕获小鼠。我们根据外部特征鉴定了所有标本到物种水平，并随后通过线粒体细胞色素b序列数据和低覆盖率全基因组序列数据证实了基于野外的鉴定。我们在现场通过异氟烷过量麻醉后颈椎脱位法处死小鼠。在将心脏和肝脏解剖并保存在RNAlater（AM7021；Invitrogen, Thermo Fisher Scientific）中后，我们将所有动物制备成博物馆标本。所有凭证标本存放于智利瓦尔迪维亚南方大学哺乳动物收藏馆（UACH）或玻利维亚拉巴斯玻利维亚动物收藏馆（CBF）。在智利和玻利维亚的采集活动均获得了相应政府机构的许可。
心脏和血液学表型测量
在实验室内，使用分析天平（SC2020；Ohaus Corp.）测量整个心脏的质量。对于每只小鼠，在立体显微镜下分别解剖左心室（包括室间隔）和右心室并分别称重。对于每个标本，使用测量的质量计算 Fulton 指数（右心室质量除以左心室和室间隔的合并质量）。在捕获每只小鼠后不久，我们从尾腹动脉抽取血样（约30 μL），然后使用Hemocue +201血红蛋白分析仪121721（Hemocue America）进行三重[血红蛋白]测量。
形态/生理表型的统计分析
统计分析和绘图在R版本4.4.0和R-studio版本2024.04.0+735中进行。我们使用线性回归评估每个物种内表型性状与原生海拔之间的关系。使用非配对t检验进行样本间表型差异检验。
RNA测序样品制备
我们使用右心室的高通量RNA测序（RNA-seq）来检测从两个阿塔卡马火山侧翼的高海拔地点收集的安第斯叶耳鼠个体间的基因表达变异：奥霍斯-德尔萨拉多山侧翼5250米处（n = 6）和尤耶亚科火山侧翼5070米处（n = 7）。文库由Azenta Life Technologies制备和测序。
RNA-seq数据处理和转录组分析
原始RNA-seq读数使用FastP进行修剪和过滤。使用HiSat2版本2.2.1将清理后的读段比对到安第斯叶耳鼠参考基因组。使用featureCounts版本2.0.3生成基因水平的读段计数。我们使用主成分分析基于五个测序指标来识别可能归因于测序伪影的异常值。这使最终样本量减少到10只小鼠（奥霍斯-德尔萨拉多山n = 6；尤耶亚科火山n = 4）。我们排除了个体间平均读段数少于20的低表达基因，保留了11,294个基因。使用edgeR包版本3.42.4中的calcNormFactors函数对读段计数进行文库大小标准化，并使用cpm函数计算对数转换的每百万读段计数（logCPM）用于下游分析。
我们采用组合分析框架来评估来自奥霍斯-德尔萨拉多山和尤耶亚科火山小鼠的基因表达谱，并测试表达谱与Fulton指数之间的关联。差异表达（DE）分析单独处理基因，识别在表现出右心室肥大差异的两个种群样本之间表达显著差异的特定基因。作为补充方法，我们使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）来识别共表达基因模块，这使我们能够发现协调的调控反应和模块水平与测量表型的关联。
差异表达分析
我们使用edgeR通过用准似然负二项广义线性模型对标准化原始计数进行建模，来识别种群间差异表达的基因。种群来源（奥霍斯-德尔萨拉多山或尤耶亚科火山）在设计矩阵中作为分类预测变量，尤耶亚科火山设为参考种群。使用准似然F检验评估显著性，并使用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）控制多重检验。基因在FDR ≤ 0.1时被认为差异表达。
对于在两个种群样本之间表现出显著差异表达的基因，我们使用gProfiler中的gost函数进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。使用每个叶耳鼠基因的小家鼠（Mus musculus）直系同源物作为查询，背景由右心室中所有表达的基因组成。富集显著性定义为FDR < 0.05。
WGCNA
使用R包WGCNA版本1.72-1在logCPM矩阵上进行共表达网络分析。我们构建了一个带符号、无标度网络，软阈值功率为25，适用于小样本量的RNA-seq数据集。通过动态树切割进行层次聚类来识别模块（最小模块大小=30；合并切割高度=0.25），并基于模块成员身份（即kME）识别每个模块的枢纽基因。在定义模块后，我们采用多步骤方法测试模块表达与Fulton指数之间的关联。我们使用由blockwiseModules返回的模块特征基因（每个模块的缩放基因表达矩阵的第一主成分）来总结模块表达。给定模块内的基因本质上是相关的，我们使用第一主成分轴，也称为模块特征基因，来表示整体模块表达。然后我们使用模块特征基因值来测试模块表达与Fulton指数之间的关联（使用Pearson相关；WGCNA中的cor函数）。我们还对秩转换后的模块特征基因值进行了方差分析，以识别哪些基因共表达模块与该表型显示出显著关联。模块-性状关联在P < 0.05时被认为是显著的。使用gProfiler通过GO和KEGG富集对包含至少10个基因的模块进行注释。
结果与讨论
我们总共收集了216只叶耳鼠的表型数据，代表四个物种：智利叶耳鼠（n = 46）、利马叶耳鼠（n = 21）、马吉斯特叶耳鼠（n = 7）和安第斯叶耳鼠（n = 142）。对于每个物种，采样海拔范围接近其已知的海拔分布。就智利叶耳鼠和安第斯叶耳鼠而言，我们从最高地点（分别为5221米和6739米）采集的标本也代表了这些物种的最高海拔记录。
体重海拔变异
体重对海拔的回归显示，除智利叶耳鼠表现出负相关关系（R = –0.36, P = 0.016）外，其他任何物种均无统计学上显著的关系。我们的叶耳鼠研究结果与伯格曼法则的海拔版本不一致，该经验法则认为体重通常向更极地（更冷）的纬度增加。
心脏质量、Fulton指数和[Hb]的海拔变异
所有物种都表现出心脏质量与海拔之间的正相关关系（R2 = 0.29 – 0.62），尽管这种关系仅对智利叶耳鼠和安第斯叶耳鼠（这两个物种具有最高的海拔分布上界）具有统计学显著性（P < 0.01）。Fulton指数未显示与海拔呈显著正相关，表明心脏质量的变异很大程度上反映了左右心室的比例性变化。因此，叶耳鼠心脏质量与海拔之间的正相关关系通常不能归因于右心室肥大，这表明这个以高地物种为主的类群可能已经进化出减弱HPH的方法，即使在智利叶耳鼠和安第斯叶耳鼠栖息的极端海拔也是如此。大多数物种表现出[Hb]随海拔升高而增加的预期趋势，但仅利马叶耳鼠和安第斯叶耳鼠的相关性显著。
在分布最广的物种安第斯叶耳鼠中，仔细检查数据表明在相对右心室质量的海拔趋势方面存在一些种群特异性特质。在该物种中，Fulton指数与海拔之间关系的轻微正趋势主要是由来自奥霍斯-德尔萨拉多山侧翼5250米处的一批极端高海拔小鼠样本驱动的，这些小鼠都显示出右心室肥大的证据。相比之下，来自尤耶亚科火山侧翼类似高海拔（5070米）的小鼠样本没有显示出这种模式。来自两个地点的小鼠在[Hb]上没有显示出显著差异。奥霍斯-德尔萨拉多山和尤耶亚科火山小鼠之间观察到的Fulton指数差异不能用种群遗传结构来解释，因为来自两个地点的小鼠构成了阿塔卡马普纳地区一个混合程度极高的基因库。然而，有理由怀疑奥霍斯-德尔萨拉多山的小鼠在极端海拔居住的历史比尤耶亚科火山的小鼠短。尤耶亚科火山5070米处的小鼠是在一个极其偏远、未受干扰的环境中捕获的，该环境接近植被的海拔极限。相比之下，奥霍斯-德尔萨拉多山5250米处的小鼠是在植被界限以上很远的地方，在阿塔卡马避难所（Refugio Atacama）附近捕获的，这是一个被登山者用作大本营庇护所的简陋小屋。这些小鼠出现在阿塔卡马避难所周围远高于植被界限的地方，可能是因为它们被登山者留下的食物储存所吸引。与可能有许多代时间来适应>5000米稀薄大气的尤耶亚科火山小鼠相比，奥霍斯-德尔萨拉多山的小鼠可能只是最近才从低海拔地区殖民到阿塔卡马避难所周围的环境。这为为什么奥霍斯-德尔萨拉多山小鼠表现出适应性较差的表型特征（右心室肥大）提供了一个可能的解释，这可能是低海拔新移民所预期的。
这两个极端高海拔地点小鼠Fulton指数的差异为研究缺氧诱导心脏质量变化的调控机制提供了一个机会。因此，我们为来自两个>5000米地点的所有采样小鼠的右心室生成了RNA-seq数据。两个高海拔小鼠样本之间的基因表达差异可以揭示奥霍斯-德尔萨拉多山小鼠右心室肥大的调控机制（即适应不良可塑性的转录基础）和/或尤耶亚科火山小鼠抑制右心室肥大的调控机制（即遗传补偿的转录基础）。
我们采用双管齐下的方法来识别右心室肥大种群差异的调控基础。我们首先进行了标准的差异表达分析，以识别两个种群（奥霍斯-德尔萨拉多山和尤耶亚科火山）之间差异表达的基因，并获得可能导致缺氧诱导右心室肥大变异的转录差异的基因中心视图。其次，使用相同的RNA-seq数据集，我们应用了网络共表达分析（WGCNA）来识别协同调控的基因套（转录模块），然后我们测试了模块表达与表型之间的关联。这种基于网络的分析提供了对与心脏表型特异性相关的调控网络的见解，并为可能协调这些网络表达的关键调控基因产生了假设。
我们获得了10个右心室样本的RNA-seq数据[奥霍斯-德尔萨拉多山（n = 6）和尤耶亚科火山（n = 4）；每个个体平均读段数 = 45,945,408]，平均基因组比对率为89.2 ± 1.6%，平均featureCounts分配率为35.9 ± 4.0%。在差异表达分析中，我们总共识别出278个在种群间差异表达（FDR < 0.1）的基因。GO富集分析显示，这套差异表达基因显著富集了65个GO类别，其中许多与横纹肌结构和免疫系统过程相关。这一结果与对高海拔和低海拔鹿鼠（P. maniculatus）的类似比较中发现的模式相呼应，这些鹿鼠在缺氧诱导右心室肥大的倾向上有所不同。在相同慢性缺氧条件下饲养时，来自美国科罗拉多州蓝天峰（约4350米海拔）的高海拔鹿鼠与低海拔同种个体相比，表现出较轻的右心室肥大。高海拔鹿鼠右心室肥大的抑制与参与免疫过程和炎症反应的关键调控基因的差异表达相关。有趣的是，在安第斯叶耳鼠高海拔种群之间差异表达的278个基因中，有68个与在高海拔鹿鼠中识别的基因重叠，表明右心室肥大背后的调控机制存在进化上的保守性。这个重叠基因子集的GO富集分析再次显著富集了参与免疫过程（例如，GO:0019883 – 内源性抗原的抗原加工和呈递）的基因。在安第斯叶耳鼠和鹿鼠中，参与免疫信号的基因的缺氧诱导表达都与右心室肥大相关，但尚不清楚观察到的基因表达变化是右心过度生长的原因还是结果。一种可能性是，观察到的相对右心室质量差异是由缺氧诱导的肺血管重构差异引起的，这样HPH程度的种群差异导致了观察到的右心室肥大和基因表达差异。然而，右心室质量的变化也可能源于对给定右心室后负荷大小产生肥大的倾向性，在这种情况下，右心室基因表达对HPH反应性的种群差异直接导致了右心室肥大的种群差异。两种机制都可能是在这里观察到的变异的基础。
生理过程是由在转录网络中相互作用的基因套调控的，其结构可以通过识别和表征共表达模块来推断。我们总共识别了103个转录模块，共同包含11,271个基因（占右心室转录组的99.8%）。转录模块的大小从23到854个基因不等。在这103个模块中，有10个与Fulton指数相关（P < 0.05）。尽管这些关联在经过FDR校正后没有一个保持显著，但我们描述了与Fulton指数相关的模块，以深入了解可能构成右心室肥大基础的调控网络。由于没有一个模块-性状关联在FDR校正后保持显著，WGCNA分析应被视为探索性的。在这些与性状相关的模块中，有六个表现出模块表达与Fulton指数之间的正相关，四个表现出负相关。这些关联主要是由两个不同地点小鼠之间模块表达的显著差异驱动的。负相关模块富集了与碳水化合物代谢（RV77）、基因表达调控（RV19）和其他生物合成过程（RV70）相关的功能，而正相关模块则富集了参与心脏发育和生长（模块RV2）、肥厚型心肌病、血液凝固和凝血（RV81）以及运动和收缩过程（RV71）的基因。差异表达和WGCNA分析共同揭示了一致的模式：显示种群水平表达差异的基因也出现在与Fulton指数相关的共表达模块中。所涉及的调控通路值得进一步研究。特别令人感兴趣的是模块RV2（R2 = 0.42；P = 0.043），它总共包含812个基因，其中几十个参与已知影响心脏生长和发育的过程。该模块的枢纽基因，junctophilin 2（Jph2），编码一种心脏结构蛋白，参与心肌细胞中连接膜复合物的组装，并在维持细胞内钙稳态和正常心脏收缩性中起重要作用。Jph2的下调与病理性心脏重构相关，并且在心脏肥大模型中该基因的过表达已被证明可以阻止心力衰竭的进展。Jph2及其他在模块RV2中共调控基因的表达变异也可能促成安第斯叶耳鼠右心室肥大倾向的变异。我们假设Jph2在奥霍斯-德尔萨拉多山小鼠中的上调反映了对HPH相关心脏应激的代偿反应，可能减弱了右心室肥大并减缓了向心力衰竭的进展。构成RV2的这组基因为后续研究右心室肥大保护性减弱的转录机制提供了一组有前景的候选基因。
结论
在高海拔的缺氧条件下，整体心脏大小的增加在生理上可能是有益的，因为这反映了心室的比例性增大，并可能允许每搏输出量和心输出量的增加，这对于支持高海拔寒冷缺氧环境下生命增加的代谢需求可能至关重要。事实上，相对心脏大小是寒冷缺氧条件下有氧运动能力的一个信息性预测指标。然而，由不成比例的右心室肥大导致的心脏整体大小增加是HPH的一个症状，这是一种明显的对缺氧的适应不良反应。因此，在高海拔地区，原生高海拔动物和近期抵达的低地移民都可能表现出缺氧诱导的心脏增大，但现有证据表明，在适应良好的高海拔哺乳动物中，这种心脏增大并不伴随不成比例的右心室肥大。在奥霍斯-德尔萨拉多山和尤耶亚科火山侧翼海拔>5000米处捕获的小鼠所经历的慢性环境缺氧水平，足以在人类和其他低地哺乳动物中诱发HPH。然而，仅在奥霍斯-德尔萨拉多山小鼠中观察到右心室肥大，而在尤耶亚科火山小鼠中未观察到，这表明后者是发现减弱HPH和右心室肥大的保护机制的良好模型。转录组分析的结果以及在其它高海拔啮齿动物中观察到的相似性，为因果机制提出了有前景的假设，特别是关于Jph2及同一调控网络中的相关基因。
