人肺动脉平滑肌与内皮细胞中内向整流性及ATP敏感性钾通道的功能表达及其在血管张力调控中的意义

《Journal of Physiology》：Functional expression of inwardly rectifying and ATP-sensitive potassium channels in human pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells

本研究首次在新鲜分离的人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）和内皮细胞（PAECs）中证实了功能性内向整流性钾通道（Kir2）和ATP敏感性钾通道（KATP）的表达。通过膜片钳电生理、免疫荧光和血管环张力测定，文章揭示了Kir2通道（Kir2.1/Kir2.2亚基）通过产生背景钾电流维持静息膜电位（VM），对基础血管张力起紧张性舒张作用，并显著增强乙酰胆碱（ACh）诱导的内皮依赖性舒张。同时，KATP通道（Kir6.1/SUR2B亚基）作为代谢传感器，可被吡那地尔（pinacidil）激活并被格列本脲（glibenclamide）和PNU-37883A阻断，其激活可引起显著的血管舒张。该研究为Kir2和KATP通道作为人肺循环电代谢调节的关键节点提供了直接证据，并为肺动脉高压（PAH）等VM失调疾病的治疗提供了新靶点。

　　

引言

肺循环在独特的调节机制下运作，以确保高效的气体交换，同时在生理条件下维持较低的血管阻力。血管细胞的静息膜电位（V_M）是动脉张力的关键决定因素，它整合了多种离子电导，以控制平滑肌收缩性和内皮细胞信号传导。在人类肺循环中，负责设定平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞（ECs）V_M的特定钾通道（K⁺）仍未完全明确。在血管SMCs中，稳态V_M由去极化和超极化离子电流的净平衡所决定，其中超极化电流主要由K⁺通道介导。其中，强内向整流性K⁺（Kir2）通道和ATP敏感性K⁺（K_ATP）通道在多种血管细胞类型的V_M调节中扮演关键角色。本研究旨在探究Kir2和K_ATP通道是否在天然的人肺动脉（PA）SMCs和ECs中有功能性表达，并评估它们对血管张力的贡献。

材料与方法

研究使用29名因肺癌接受肺叶切除术患者的非肿瘤肺组织。通过酶消化法新鲜分离人肺动脉阻力血管的单个SMCs和ECs。采用常规全细胞膜片钳技术记录离子电流，使用免疫荧光法检测Kir2.1、Kir2.2、Kir6.1和SUR2亚基的蛋白表达。利用血管环肌动图评估血管反应性，观察药物对血管张力的影响。

人肺动脉平滑肌细胞表达功能性Kir2通道

在新鲜分离的人PASMCs中，膜片钳记录显示，在高钾（60 mM）细胞外液条件下，可记录到显著的向内电流。应用选择性Kir2通道阻断剂氯化钡（BaCl₂, 100 μM）后，该内向电流在膜电位负于钾平衡电位（E_K≈ -23 mV）时被显著抑制，而外向电流基本不受影响。Ba²⁺敏感电流成分表现出Kir2通道特有的内向整流特性。平均而言，Ba²⁺使-140 mV处的峰值内向电流密度降低了约75%。电流钳记录发现，在生理细胞外钾浓度（5 mM）下，BaCl₂可引起PASMCs显著去极化，静息膜电位从-44.9 mV变为-30.4 mV。免疫细胞化学结果证实，在α-平滑肌肌动蛋白阳性的PASMCs中存在Kir2.1和Kir2.2亚基的表达，且与质膜标记物共定位，表明其膜定位。

人肺动脉内皮细胞表达功能性Kir2通道

在新鲜分离的人PAECs中，同样观察到了Ba²⁺敏感的内向电流，其具有Kir2通道的典型电生理特征。值得注意的是，PAECs中的Kir2电流幅度约为PASMCs中的两倍，而电压门控钾通道介导的外向电流贡献很小。通过内皮细胞特异性标志物CD31鉴定的内皮层，其免疫荧光分析显示Kir2.1和Kir2.2亚基在内皮细胞有强阳性表达，并与质膜标记共定位。

Kir2通道是人肺动脉张力的关键调节因子

在分离的PA环中，累积加入选择性抑制Kir2通道的BaCl₂（3–100 μM）可引起浓度依赖性的血管收缩。这种收缩反应可被L型钙通道阻滞剂硝苯地平（1 μM）所减弱，表明Kir2通道抑制导致的去极化激活了电压门控钙通道，引起钙内流和收缩。在由U46619预收缩的PA环中，乙酰胆碱（ACh）可诱导浓度依赖性的内皮依赖性舒张。而BaCl₂（100 μM）预处理显著减弱了ACh诱导的舒张反应。然而，BaCl₂对硝普钠（SNP）诱导的内皮非依赖性（直接作用于平滑肌）舒张反应没有显著影响，表明Kir2通道主要影响内皮功能，而非平滑肌对一氧化氮（NO）的敏感性。这些结果证实Kir2通道通过维持内皮细胞功能，在调节基础张力和内皮依赖性舒张中发挥关键作用。

功能性Kir6.1/SUR2B K_ATP通道在人肺动脉平滑肌细胞中的表达

为探究K_ATP通道的功能，研究在低ATP/高ADP的细胞内液条件下记录PASMCs的电流。应用K_ATP通道开放剂吡那地尔（pinacidil, 10 μM）可诱发显著的内向电流。此电流可被经典的K_ATP通道阻断剂格列本脲（glibenclamide, 10 μM）或对血管型Kir6.1/SUR2B通道更具选择性的抑制剂PNU-37883A（10 μM）所逆转。免疫细胞化学证实了PASMCs中Kir6.1孔道形成亚基和SUR2调节亚基的表达及其膜定位。

人肺动脉内皮细胞表达功能性Kir6.1/SUR2B K_ATP通道

在PAECs中，同样观察到了由吡那地尔激活、并可被格列本脲或PNU-37883A阻断的功能性K_ATP电流。免疫荧光分析进一步在完整内皮层中确认了Kir6.1和SUR2亚基的表达。这表明人PAECs也表达功能性的、对药物有反应的Kir6.1/SUR2B K_ATP通道。

K_ATP通道激活诱导人肺动脉舒张

在肌动图实验中，吡那地尔（0.03–30 μM）对U46619预收缩的人PA环产生浓度依赖性的舒张作用。此舒张反应可被格列本脲（10 μM）或PNU-37883A（30 μM）预处理显著减弱。这表明功能性K_ATP通道在人PA的血管舒张调节中扮演重要角色。

讨论

本研究首次在新鲜分离的天然人PASMCs和PAECs中提供了Kir2和K_ATP通道功能性表达的直接证据。Kir2通道（可能由Kir2.1和Kir2.2亚基组成）在设定和稳定静息膜电位方面发挥关键作用，其抑制会导致膜去极化、钙内流增加和血管收缩。同时，Kir2通道对于乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张至关重要。K_ATP通道（由Kir6.1和SUR2B亚基组成）则作为代谢传感器，其激活可引起膜超极化和血管舒张。这两种钾通道在肺动脉平滑肌和内皮细胞中的双重分布，提示它们可能在血管壁中协调作用，共同调节膜电位和血管张力，是肺循环电代谢耦合的关键节点。这些通道功能的失调可能与肺动脉高压（PAH）等疾病的病理机制有关，使其成为潜在的治疗靶点。