通过葫芦[8]脲（cucurbit[8]uril）超分子组装来调节肉桂酰香豆素–RGD肽缀合物的光动力活性

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Modulation of the photodynamic activity of a cinnamoyl-coumarin–RGD peptide conjugate via cucurbit[8]uril supramolecular assembly

本研究合成并表征了新型肽基光敏剂PS-GG(KG)?G-RGD，通过超分子结合CB[8]实现稳定性增强与光物理调控，显著提升MCF-7乳腺癌细胞的光毒性，为靶向光疗剂设计提供新策略。

　　

本杰明·苏尼加（Benjamín Zú?iga）|保拉·S·里韦罗-赫雷斯（Paula S. Rivero-Jerez）|索菲亚·佩雷斯-德尔皮诺（Sofia Pérez-Del Pino）|弗朗西斯科·布拉沃-卡贝萨斯（Francisco Bravo-Cabezas）|弗朗西斯科·穆拉（Francisco Mura）|巴勃罗·巴里亚斯（Pablo Barrias）|克劳迪奥·阿库尼亚-卡斯蒂略（Claudio Acu?a-Castillo）|马里奥·A·富恩德斯（Mario A. Faúndez）|亚历克西斯·阿斯佩（Alexis Aspeé）|丹尼尔·苏尼加-努涅斯（Daniel Zú?iga-Nú?ez）|丹尼斯·富恩特阿尔巴（Denis Fuentealba）

智利圣地亚哥大学化学与生物学学院光动力学与光化学实验室，地址：Casilla 40, Correo 33, 圣地亚哥，智利

摘要

基于肽的光敏剂（PSs）已成为克服传统光敏剂在光动力疗法（PDT）中局限性的一种有效策略，这些局限性包括水溶性差、选择性低以及光毒性效率有限。在本研究中，我们合成并表征了一种新型的肉桂酰-香豆素-RGD肽缀合物（PS-GG(KG)?G-RGD），该缀合物结合了肿瘤靶向能力、改善的水溶性和通过葫芦[8]脲（CB[8]）配合物调节光动力活性的功能。圆二色性分析显示该缀合物具有稳定的β-折叠结构及高温稳定性。在多种溶剂中评估了PS-GG(KG)?G-RGD的光物理行为，发现其激发态动力学受溶剂影响，包括内部电荷转移（ICT）和扭曲内部电荷转移（TICT）激发态的形成。与CB[8]的超分子复合物形成1:1的包合物，这一结果通过质谱和Job图得到证实；荧光滴定显示其结合常数为（5.0 ± 0.2）× 10⁶ M^-1，并且在酸性条件下仍保持稳定。值得注意的是，PS-GG(KG)?G-RGD与CB[8]的结合并未显著改变单线态氧的生成。在MCF-7乳腺癌细胞系中的体外光毒性实验表明，这种超分子组装显著增强了肿瘤细胞的光毒性。这些发现支持将超分子技术与肽缀合结合用于光敏剂设计，作为开发新型光治疗剂的有前景的方法。

引言

基于肽的策略已成为开发第三代光敏剂（PSs）以用于癌症治疗的强大工具，显著提高了其溶解性、稳定性、生物相容性和靶向特异性。[1]、[2] 这些经过肽序列修饰的光敏剂可以改善药代动力学，并增强在肿瘤细胞中的选择性积累，有效克服了前代产品的局限性。[3] 细胞摄取和肿瘤渗透/保留能力也能得到提升，这些都是最大化光动力疗法（PDT）治疗效果的关键参数。[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。

PDT作为一种微创且高效的治疗方法而备受关注。[10]、[11]、[12]、[13] 在分子氧存在下对光敏剂进行光照会产生活性氧（ROS），这些活性氧通过控制照射区域在恶性组织中引发细胞毒性效应。[14]、[15]、[16] 光敏剂对肿瘤目标的局部作用机制减少了全身毒性，并避免了化疗和放疗等传统疗法相关的癌症复发风险，使PDT成为肿瘤学应用中的有希望的选择。[17]、[18]

基于肽的靶向策略的发展进一步推动了PS递送的精准性。RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）基序的引入提高了PS与整合素受体（如α_vβ₃和α_vβ₅）的亲和力，这些受体在肿瘤细胞和血管生成过程中过度表达。[19]、[20]、[21]、[22]、[23] 这种特异性相互作用不仅增强了PS的细胞摄取，还提高了其在肿瘤中的滞留，从而优化了PDT的选择性和效果。因此，RGD修饰的PS代表了实现靶向光毒性的精细策略，减少了脱靶效应并最大化了治疗效果。此外，将带正电的肽与PS结合可以克服光敏剂在水介质中常见的溶解性和聚集问题，这些问题会阻碍光毒性并降低光动力疗法（PDT）的整体效果。[24]、[25]

新型诊疗光敏剂的开发与应用对于实时监测细胞环境和肿瘤微环境特别有利，在这些环境中，pH值和极性的变化可以指示代谢活动、疾病进展或治疗反应。[26] 最近，我们发现肉桂酰-香豆素杂化物具有双重功能：既可作为光敏剂，也可作为对粘度和溶剂极性敏感的微环境探针。[27]、[28] 此外，肉桂酰-香豆素杂化物表现出优异的光物理特性，包括在可见光区域的强吸收、高效的单线态氧生成以及极性依赖的荧光发射，使其在PDT、生物成像和诊疗策略中具有很高的应用价值。[29]、[30]

为了进一步增强PDT的效果，可以使用作为纳米载体的超分子系统，例如脂质体[31]、胶束[32]和聚合物纳米颗粒[33]。这些纳米载体提高了光敏剂在血液中的稳定性和循环时间，保护其免于过早降解，并通过增强渗透性和滞留效应促进被动肿瘤靶向。[34]、[35] 其中，像葫芦[7]脲（CB[7]）这样的宏环化合物在保护光敏剂和递送方面展现了巨大潜力。[30]、[36]、[37]、[38]、[39] 更近期的研究还探索了更大的同系物葫芦[8]脲（CB[8]），它有助于小分子（如荧光探针）的超分子组装，保护其免受降解[40]，同时具有最佳的药物装载能力。[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48] 体内研究表明，静脉注射的CB[7]会迅速从血清中排出并在肾脏中达到高浓度，而口服的CB[8]吸收较差，因此通过粪便以未修饰的形式排出。[50]

在本研究中，我们开发了一种新型的基于肽的光敏剂缀合物，它与CB[8]非共价结合，形成保护性纳米胶囊（图1）。这一设计旨在结合我们团队先前报道的肉桂酰-香豆素杂化物的光物理特性[30]，通过RGD序列实现肿瘤靶向，通过富含赖氨酸的亲水肽桥提高溶解性，并利用CB[8]提供的保护性封装，从而增强PDT应用中的溶解性、稳定性和选择性。[51]、[52]

试剂

香豆素334（C₃₃₄）、4-甲酰苯甲酸、哌啶、三氟乙酸（TFA）和1,2-葫芦[8]脲水合物（CB[8]）购自Sigma-Aldrich公司。Rink Amide MBHA树脂、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、哌啶、N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）、Oxyma Pure、三异丙基硅烷（TIS）购自Iris Biotech Gmbh公司。磷酸二氢钠一水合物（NaH₂PO₄·H₂O）、无水磷酸二氢钠（Na₂HPO₄）和二甲胺购自其他供应商。

肉桂酰-香豆素-GGKGKGKGKGG-RGD（PS-GG(KG)₃G-RGD）缀合物

通过圆二色性（CD）研究分析了肽序列的构象。如图1A所示，PS-GG(KG)?G-RGD的吸收光谱最大值位于195 nm，最小值位于220 nm，这是β-折叠结构的特征。此外，通过将温度从20°C升高到80°C来评估肽的热稳定性，未观察到CD光谱的显著变化，表明PS-GG(KG)?G-RGD保持了其结构稳定性。

结论

本研究探讨了肉桂酰-香豆素肽缀合物PS-GG(KG)₃G-RGD在均匀介质中的光物理性质、结合相互作用和光毒性效应，以及其与CB[8]的超分子复合物形成。值得注意的是，PS-GG(KG)?G-RGD与CB[8]之间存在强烈的主客体相互作用，调节了其激发态动力学。形成了稳定的包合物，在生理和微酸性条件下保持完整。

CRediT作者贡献声明

本杰明·苏尼加（Benjamín Zú?iga）： 数据分析、数据处理。保拉·S·里韦罗-赫雷斯（Paula S. Rivero-Jerez）： 文章撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析。索菲亚·佩雷斯-德尔皮诺（Sofia Pérez-Del Pino）： 数据分析。弗朗西斯科·布拉沃-卡贝萨斯（Francisco Bravo-Cabezas）： 实验研究、数据分析。弗朗西斯科·穆拉（Francisco Mura）： 数据分析、概念构建。巴勃罗·巴里亚斯（Pablo Barrias）： 数据分析。克劳迪奥·阿库尼亚-卡斯蒂略（Claudio Acu?a-Castillo）： 数据分析、概念构建。马里奥·A·富恩德斯（Mario A. Faúndez）： 实验研究、数据分析。

利益冲突声明

无。

致谢

非常感谢FONDECYT（资助编号1231468）和CONICYT FONDEQUIP UHPLC（资助编号MS/MS EQM 120065）的财政支持。D·F感谢FONDECYT（资助编号1210583和1251176）的支持。F·M感谢DICYT（常规资助编号022543RS）的支持。P·S·R-J感谢FONDECYT（博士后资助编号3240507）以及CONICYT FONDEQUIP-EQM160063、FONDEQUIP-EQM150106和FONDEQUIP-EQM230048的支持。BZ感谢智利圣地亚哥大学研究生院的博士奖学金。作者们表示感谢。