利用类固醇激素衍生物靶向胆碱酯酶：来自体外实验和分子建模的见解

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Targeting Cholinesterases with Steroid Hormone Derivatives: Insights from In Vitro Assays and Molecular Modeling

本研究筛选了12种具有不同取代基的甾体衍生物，评估其体外抑制人AChE和BChE活性。结果显示，含吡啶的化合物8对BChE抑制效果显著（IC50=2.76 μM），与临床药物相当。分子对接表明疏水相互作用是主要结合机制，为阿尔茨海默病治疗提供了新方向。

　　

Jovana J. Ajdukovi? | Ana Mato?evi? | Anita Bosak | Strahinja Kova?evi? | Milica Karad?i? Banjac | Ivana Z. Kuzminac | Andrea R. Nikoli? | Marina P. Savi?

塞尔维亚诺维萨德大学科学学院化学、生物化学与环境保护系，Trg Dositeja Obradovi?a 3号

摘要

类固醇是一大类有机化合物，作为信号分子，在多种生理过程中发挥着重要作用，包括调控代谢途径、炎症反应、免疫应答以及生长发育和繁殖。通过修改类固醇的核心结构，人们成功合成了许多新的衍生物，这些衍生物在医学上可用于治疗多种病理状况。许多天然类固醇已被证实是有效的胆碱酯酶抑制剂，这为它们在阿尔茨海默病（AD）的治疗中提供了潜在的应用前景。然而，迄今为止只有少数合成类固醇被研究作为胆碱酯酶抑制剂，因此仍有很大的开发空间，可以从天然类固醇结构中开发出新的治疗药物。在本研究中，我们选取了一组结构多样的类固醇激素衍生物，并在体外评估了它们对人类AChE和BChE的抑制活性。其中一些最活跃的化合物（尤其是含有吡啶羟基的化合物8）表现出对BChE的强抑制作用（IC50值为2.76 μM），其抑制效果与临床使用的胆碱酯酶抑制剂相当。计算机模拟分析表明，这些化合物与酶活性位点中的关键氨基酸残基之间的疏水相互作用是其结合的主要机制。

引言

全球约有5500万人患有痴呆症，其中近60-70%为阿尔茨海默病（AD）。这是一种无法治愈的神经退行性疾病，主要影响65岁以上的人群。[1],[2] 目前可用于治疗阿尔茨海默病的药物主要是通过缓解症状或减缓疾病进展来发挥作用。[3],[4] 缓解症状的方法包括调节负责分解乙酰胆碱（ACh）的酶的活性，或者使用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂。[3],[4],[5],[6] 在过去五年中，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种针对阿尔茨海默病主要病理特征（即患者大脑中的淀粉样蛋白斑块）的药物。[7],[8]

在人体中，ACh的水平由两种胆碱酯酶调节：乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE），这两种酶负责将ACh水解为胆碱和乙酸。[9],[10] AChE的生理作用是通过分解乙酰胆碱来终止大脑和周围组织中的神经信号传递。此外，AChE还参与胚胎干细胞分化、AChE-β-淀粉样蛋白复合物的形成、神经突起的生长以及多巴胺能神经元的激活等过程。[11],[12] BChE在清除体内的各种外源性物质方面发挥着重要作用，并与神经发生有关。[13],[14],[15] 当AChE的活性受到抑制时（例如由于有机磷或氨基甲酸酯类农药等神经毒素的作用），或者在大脑淀粉样蛋白斑块积累严重的阿尔茨海默病晚期，BChE的活性会显著升高（达到正常值的约120%），BChE也会对ACh的传递起到调节作用。[9]

胆碱酯酶抑制剂（ChEIs）通过与胆碱酯酶活性位点结合或与其催化Serine残基形成共价键来阻止ACh的分解。这些抑制剂在抑制效力、作用机制以及对AChE或BChE的选择性方面存在差异。[16] 由于BChE在阿尔茨海默病后期调节大脑乙酰胆碱水平中的作用，且动物实验表明选择性抑制BChE相比AChE对认知功能有积极影响，因此选择性抑制BChE已成为治疗阿尔茨海默病的一种有前景的方法。[3],[17],[18]

自1989年首个胆碱酯酶抑制剂塔克林（Tacrine）获得用于治疗阿尔茨海默病的专利以来，已经设计、合成并测试了大量潜在的胆碱酯酶抑制剂。然而，至今只有少数新药上市。其主要原因是这些化合物需要能够穿过血脑屏障才能在中枢神经系统中发挥最佳效果。此外，使用胆碱酯酶抑制剂常常会伴随严重的副作用。鉴于上述使用障碍以及阿尔茨海默病发病率的持续上升，迫切需要开发具有全新化学结构且药理特性更优的新化合物。

天然类固醇基于胆固醇的相似结构，经过进化优化后能够跨细胞壁和膜传递信号，充当调节代谢、免疫和生殖功能的化学信使。通过修饰类固醇核心，人们开发出了具有多种生物活性的合成衍生物，如抗寄生虫、抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌活性。[20],[21],[22],[23],[24] 许多来自海洋和植物的类固醇已在体外研究中作为治疗阿尔茨海默病的候选药物进行测试。其中，多种甾体生物碱、胆固醇烷、豆甾烷和谷甾醇衍生物被证明对AChE和BChE具有中等或高度的抑制作用。[25],[26],[27],[28],[29],[30] 一些蘑菇物种中也发现了具有胆碱酯酶抑制活性的天然类固醇，如麦角甾烷和β-谷甾醇。然而，关于含有类固醇核心的合成化合物作为胆碱酯酶抑制剂和神经保护剂的研发工作仍然很少。[31],[32],[33]

在本研究中，我们选择了十二种先前在我们实验室合成的雌烷和雄烷衍生物，这些衍生物在A环和/或D环上具有不同的杂环结构。所有化合物都经过了对AChE和BChE抑制能力的筛选，其中活性最强的化合物的IC50值也被确定。我们还通过计算机模拟预测了这些化合物穿过血脑屏障的能力，并利用分子对接技术分析了它们在AChE和BChE活性位点上的潜在结合位点。鉴于目前关于合成类固醇作为胆碱酯酶抑制剂的研究有限，本研究为开发新型类固醇基治疗药物做出了重要贡献。此外，本研究发现某些含吡啶的化合物是BChE的选择性抑制剂，这与迄今为止报道的大多数类固醇AChE抑制剂不同。

本研究中测试的雌烷和雄烷衍生物系列

这些类固醇衍生物最初是为评估其作为抗癌药物的潜力而设计和合成的。[34],[35],[36],[37],[38],[39],[40],[41],[42] 根据它们的分子结构，这些化合物可分为四组（表1）：

• •
  第一组包含四种羟基亚胺和腈类化合物
  14
• •
  第二组包含三种D-内酯衍生物
  57
• •
  第三组包含五种

对人类AChE和BChE的抑制活性

所有化合物均被测试作为人类乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的潜在抑制剂。通过测定100 μM底物浓度和100 μM抑制剂浓度下的胆碱酯酶抑制百分比来评估它们的抑制能力（表2）。同时，也测定了多奈哌齐（donepezil）的抑制百分比，后者是目前最常用的治疗阿尔茨海默病的药物。

结论

通过对我们的类固醇衍生物进行评估，我们发现了一些影响其与胆碱酯酶（尤其是BChE）结合亲和力的因素。具体来说，将吡啶结构引入类固醇的D环并在C-3位引入羟基，使得化合物8对hBChE的抑制活性达到微摩尔级别（IC50 = 2.76 μM）。分子对接分析表明，这些化合物主要通过特定的结合模式与酶活性位点结合。

作者贡献声明

Anita Bosak：撰写初稿、资源获取、资金申请、数据分析。 Ana Mato?evi?：方法设计、实验实施、数据分析、数据管理。 Jovana J. Ajdukovi?：撰写初稿、指导研究、资源获取、概念构思。 Andrea R. Nikoli?：撰写修订稿、资源协调。 Ivana Kuzminac：撰写初稿、实验实施、数据管理。 Milica Karad?i? Banjac：实验设计、数据分析。 Strahinja Kova?evi?：撰写初稿。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢塞尔维亚共和国科学、技术发展与创新部提供的财政支持（项目编号：451-03-137/2025-03/200125、451-03-136/2025-03/200125和451-03-137/2025-03/200134）。本研究还得到了欧盟Next Generation BioMolTox项目（项目编号：643-02/23-01/00016，注册号：533-03-23-0006）的支持，该项目使用了欧洲区域发展基金KK.01.1.1.02.0007项目提供的设施和设备。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。