《Journal of Virological Methods》：A new real-time RT-PCR for the detection of piscine orthoreoviruses PRV-1 and PRV-3
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新开发一步RT-qPCR方法靶向PRV L1基因片段，经法国标准NF U47-600验证，能特异性检测PRV-1和PRV-3，灵敏度达1000拷贝，适用于虹鳟鱼和鲑鱼养殖的病理诊断。
Laurane Pallandre | Marine Baud | Emma Rolland | Alexiane Talbodec | Laurent Bigarré
Ploufragan-Plouzané-Niort实验室，ANSES，29280 Plouzané，法国
摘要
鱼类正链病毒（PRV）常与影响多种鲑鱼物种的病理状况相关，尤其是养殖鱼类。无论是监测还是研究目的，都需要能够检测到最常见基因型的分子诊断工具，即PRV-1和PRV-3。我们建立了一种新的一步法逆转录实时PCR（RT-qPCR）技术，该技术针对L1片段的保守区域。基于法国标准NF U47-600，这种PCR方法被证明对PRV具有特异性，可以排除其他鲑鱼病毒。该检测方法能够检测到1000个PRV-3合成转录本的拷贝，无论是纯的还是与健康鱼类的核酸混合的。该检测方法产生的信号与之前使用针对不同病毒片段的通用检测方法观察到的信号相似。这种新方法可靠，可用于检测虹鳟鱼和大西洋鲑鱼中的PRV-1和PRV-3。
引言
在法国，虹鳟鱼（Onchorynchus mykiss）是主要的养殖鱼类，占鲑鱼产量的97%（Strosser等人，2021年）。剩余的3%由褐鳟鱼（Salmo trutta）和其他物种组成，如大西洋鲑鱼（Salmo salar）、灰鲑（Thymallus thymallus）、北极红点鲑（Salvenimus alpinus）和溪鳟（Salvelinus fontinalis）。在这些物种中，大西洋鲑鱼、虹鳟鱼和褐鳟鱼是鱼类正链病毒（PRV）的潜在宿主，PRV属于Orthoreovirus piscis物种（Spinareoviridae科），可导致鱼类心脏和其他器官的病理变化。该病毒主要攻击循环系统，并在红细胞等细胞类型中复制（Finstad等人，2014年；Wessel等人，2018年）。因此，心脏、肾脏和脾脏等高度血管化的器官是最适合进行诊断的器官。
已经描述了多种PRV基因型和亚型。大西洋鲑鱼感染PRV-1基因型可能导致心脏和骨骼肌炎症（HSMI），这种病理状况最初于20世纪90年代末在挪威的养殖大西洋鲑鱼中发现，现在被认为是该国鲑鱼养殖中的一个严重问题（Kongtorp等人，2004年；Moldal等人，2025年；Wessel等人，2017年）。尽管病毒流行率和发病率可能很高，但死亡率可能较低或中等（0-20%）（Moldal等人，2025年）。PRV-3基因型与影响虹鳟鱼和褐鳟鱼的类似HSMI的病理状况有关（Dhamotharan等人，2018年；Hauge等人，2017年；Olsen等人，2015年）。然而，在智利也发现了PRV-3感染的大马哈鱼（Godoy等人，2021年）。第三种基因型PRV-2会导致类似HSMI的病理状况，最初被称为病毒性红细胞包涵体综合征（EIBS）。迄今为止，EIBS仅在日本和美国有报道（Leek，1987年；Takano等人，2016年）。
PRV是一种无包膜病毒，其基因组为分段的双链RNA，由10个大小不一的线性片段组成（L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4），长度大约在1到3.9 kb之间（Kibenge等人，2013年；Markussen等人，2013年；Palacios等人，2010年）。尽管多次尝试，PRV仍无法在细胞培养中培养（Polinski等人，2020年）。因此，开发了多种分子扩增方法来检测这些基因组片段。这些方法大多针对PRV-1或PRV-3，虽然对研究有用，但尚未根据相关的诊断标准进行验证。例如，传统的RT-PCR（RT-cPCR）和基于TaqMan的实时RT-PCR（RT-qPCR）已被用于扩增PRV-1的L1片段（Palacios等人，2010年）。PRV-1的S1片段也通过RT-cPCR进行检测（在本研究中称为S1-cPCR）（Garseth、Ekrem和Biering，2013年）。此外，其他研究也使用RT-qPCR检测PRV-1的S1片段（Siah等人，2020年）。还有研究使用RT-qPCR扩增PRV-3的S1片段（Olsen等人，2015年）。
最后，几年前发表了一种通用的、经过验证的检测方法（Zhao等人，2021年）。该方法使用一对引物和FAM-MGB探针，以相同的灵敏度和特异性检测PRV-1、PRV-2和PRV-3的M2片段。此后将这种方法称为M2-qPCR。
在法国，分别在野生和大西洋鲑鱼中检测到了两种PRV-1亚型，即PRV-1a和PRV-1b（Bigarré等人，2018年）。PRV-3也被发现感染养殖的虹鳟鱼和褐鳟鱼，通常但并非总是伴随类似HSMI的症状。到目前为止，在法国只发现了PRV-3b亚型。2019年，我们设计了针对PRV-1和PRV-3 L1片段的分子探针，用于常规RT-qPCR诊断。如果未来出现携带M2靶点突变的PRV-1或PRV-3菌株，这种通用的基于qPCR的方法可能成为M2-qPCR的一个有趣替代方案。该方法也适用于Ct值非常低（接近阈值）或完全没有Ct值的样本，以及区分低阳性和阴性结果。此外，一种通用的标准化测试也有助于监测PRV-1或PRV-3感染期间L1和M2基因的表达动态。在这里，我们证明了这种检测方法已经根据法国标准NF U47-600（AFNOR，2015年）进行了验证，是一种可靠的替代方案或补充方案。
样本
样本
所有可疑的鲑鱼样本均采集于2015年至2020年间，在法国养殖虹鳟鱼、褐鳟鱼或大西洋鲑鱼的渔场。对于幼鱼和成鱼，采集了心脏和脾脏样本。如果样本用于检测除PRV-1和PRV-3以外的其他鲑鱼病毒，还会采集肾脏和大脑样本。当鱼太小而无法准确解剖时（例如鱼苗），则从整个腹腔采集样本。
为了验证新的L1-qPCR方法
L1-qPCR的特异性
在30个通过S1-qPCR检测呈阳性的虹鳟鱼和褐鳟鱼样本中，所有样本也通过L1-qPCR检测呈阳性（Ct值：21.84至35.18），证明了我们新方法检测PRV-3的能力。相反，有18个样本在S1-qPCR和L1-qPCR方法中均呈阴性。因此，该测试的包容性为100%。此外，6个通过S1-cPCR检测呈阳性并通过测序鉴定为PRV-1的样本，也通过L1-qPCR检测呈阳性（Ct值：11.97至34.25）。
讨论
PRV在全球许多鲑鱼养殖场中广泛存在（Polinski等人，2020年；Sorensen等人，2020年）。迄今为止，已描述了三种主要基因型和几个亚型。每种基因型主要感染特定的鲑鱼物种。在欧洲，PRV-3主要存在于虹鳟鱼和褐鳟鱼中，而PRV-1仅存在于大西洋鲑鱼中。然而，PRV-3和PRV-1都可以在褐鳟鱼中复制（Purcell等人，2020年）。
资助
本工作得到了ANSES和新阿基坦大区的资助（项目REOTAC）。
CRediT作者贡献声明
Laurane Pallandre：撰写——初稿编写、数据可视化、调查、数据管理。
Marine Baud：撰写——初稿编写、数据可视化、监督、调查。
Emma Rolland：调查。
Alexiane Talbodec：调查。
Laurent Bigarré：撰写——审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢Carolyn Engel-Gautier对英文的修改。
