《Journal of Virological Methods》：Development of a rapid and portable detection method for canine distemper virus based on CRISPR-Cas13a
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开发了一种结合重组酶辅助扩增（RAA）、CRISPR-Cas13a和侧流层析法的快速检测方法，灵敏度达102拷贝/μL，检测时间1.5小时，与RT-PCR结果一致，适用于现场犬瘟热病毒诊断
姜玉轩|杨在兴|杨佳梅|李一凡|刘家琪|赵莉莉|葛俊伟
中国哈尔滨市，东北农业大学兽医学院，人畜共患病黑龙江省重点实验室，邮编150030
摘要
犬瘟热病毒（CDV）是一种致病微生物，会严重损害呼吸系统、消化系统和神经系统，导致多系统症状。它几乎感染全球所有陆地食肉动物，尤其是犬科和鼬科动物，对全球社会经济和公共卫生安全构成严重威胁。鉴于病因治疗和早期诊断的重要性，开发具有更高准确性、快速性和用户友好性的新型检测方法对于有效预防和控制CDV感染至关重要。在本研究中，我们建立了一种结合重组酶辅助扩增（RAA）和CRISPR-Cas13a的新检测方法，并优化了CRISPR RNA（crRNA）和Cas13a的工作浓度，用于CDV的侧向流动检测（LFD）。该RAA-CRISPR-Cas13a-LFD方法不会与其他常见的犬类病原体发生交叉反应，其灵敏度可检测低至102拷贝/μL的CDV cDNA质粒。此外，结合HUDSON技术，这种RAA-CRISPR-Cas13a-LFD方法可在1.5小时内检测临床样本，其性能与RT-PCR相当。RAA-CRISPR-Cas13a的检测结果可以通过荧光或侧向流动条带进行可视化，适用于现场病毒诊断。总体而言，我们开发的方法在即时检测（POCT）方面显示出良好潜力，有助于控制和减少CDV感染造成的损失。
引言
犬瘟热病毒（CDV）属于麻疹病毒属（副黏病毒科），是一种高度传染性且常致命的多系统疾病（Bi等人，2015年；Rima等人，2019年）。它具有非分段的负链单链RNA基因组，编码六种结构蛋白，即核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大蛋白（L）以及两种非结构蛋白（C和V）（Rendon-Marin等人，2019年）。编码N蛋白的基因常被选为CDV核酸检测的目标区域（Fu等人，2016年；Wang等人，2017年；Xu等人，2012年），其变异程度较低（Ricci等人，2021年；Rima等人，1995年；Wipf等人，2025年）。CDV可通过直接接触或间接接触（如气溶胶传播和接触呼吸道及眼部分泌物）广泛感染犬科和鼬科的食肉动物，包括狗、水貂、狐狸和貉（Deem等人，2000年；Zhou等人，2024a）。据报道，它还能通过狗传播给许多野生食肉动物，如西伯利亚虎、埃塞俄比亚狼和其他濒危物种（Zhang等人，2017年），以及猎豹和狮子（Mourya等人，2019年；Zhang等人，2017年），被认为是多种家养和野生动物新的病毒风险（Seimon等人，2013年）。
由CDV引起的犬瘟热（CD）是一种在全球范围内发病率高且死亡率高的地方性疾病，在寒冷季节发病率更高（Karki等人，2022年；Martella等人，2008年）。在早期阶段，感染动物可能表现出非特异性临床症状，如厌食、抑郁、结膜炎和趾部角化过度。然而，疾病会发展为严重的呼吸系统、胃肠道和神经系统症状，导致多系统症状（Iribarnegaray等人，2024年）。在此过程中，动物的免疫系统也会受到影响，导致严重的免疫抑制，出现双相发热、咳嗽、腹泻和厌食等症状（Karki等人，2022年）。犬类的神经系统症状通常是致命的，幸存者会表现出持续的神经功能障碍，需要终生管理（Iribarnegaray等人，2024年）。因此，快速准确的CDV诊断方法对于及时识别亚临床携带者和在感染早期提供病因治疗至关重要，从而防止临床症状恶化并遏制病毒向易感宿主的传播。
虽然常规临床发现可以为CDV感染提供初步诊断支持，但由于无症状携带者的普遍存在以及感染动物在病毒早期阶段缺乏特异性临床表现，这些发现不足以进行确诊（Rivera-Martínez等人，2024年）。因此，实施经过验证和标准化的CDV诊断方法对于生成重要的流行病学数据以指导治疗策略、优化疫情控制方案和降低高密度犬群中的传播风险至关重要。传统的检测方法由于CDV的致病特性或检测方法的局限性，不适合快速、方便和准确的CD诊断。病毒分离虽然具有确诊能力，但耗时较长（数天至数周），不适合临床使用（Elia等人，2006年；Rivera-Martínez等人，2024年）。目前，如ELISA等血清学检测方法具有相对较高的灵敏度和特异性，但之前的疫苗接种和/或感染状态可能会影响检测结果（Egerer等人，2022年；Elia等人，2006年；Sarchahi等人，2022年）。相比之下，核酸检测方法可能是一种更可靠的检测方法，能够应对不同情况（Wang等人，2018年）。尽管逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）具有高灵敏度，但它们需要专用设备和受过培训的人员，限制了其在即时检测（POCT）中的应用（Becker等人，2024年；Hu等人，2022年；Zhou等人，2023年）。因此，迫切需要快速、无需设备且可在现场使用的诊断工具。
规律间隔的短回文重复序列簇和相关核酸酶（CRISPR-Cas）系统为快速和敏感的分子诊断提供了潜在应用（Chen等人，2018年；Gootenberg等人，2018年）。CRISPR-Cas系统是一种RNA引导的适应性免疫系统，可保护细菌和古菌免受外来核酸的入侵（Abudayyeh等人，2016年；Barrangou等人，2007年；Marraffini和Sontheimer，2008年）。CRISPR-Cas13a系统通过识别和检测目标RNA序列来激活Cas核酸酶的切割/降解活性，无差别地切割附近的单链RNA（ssRNA）。实验研究表明，CRISPR-Cas13a具有单碱基对识别能力（Gootenberg等人，2017年），这是保持核酸识别高准确性的关键特性。在检测系统中添加两端标记有荧光素或抗原的单链RNA作为报告分子，最终检测结果可通过qPCR仪器或侧向流动条带显示，肉眼可见。结合等温扩增步骤（如重组酶聚合酶扩增（RPA）/重组酶辅助扩增（RAA）技术，在37–42°C温度范围内扩增核酸，基于CRISPR-Cas13a的检测方法通常可以实现敏感和快速的检测过程（Zhang等人，2022年）。近年来，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术在快速准确诊断主要人类和动物传染病方面取得了显著成功，如2019冠状病毒病（COVID-19）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、禽流感病毒（AIV）、猴痘病毒和传染性胃肠炎病毒（TGEV）（Hu等人，2022年；Wang等人，2024a；Wang等人，2024b；Wu等人，2023年）。在本研究中，我们旨在建立一种结合RAA、侧向流动条带和CRISPR-Cas技术的新型平台，用于CDV RNA检测，该方法既准确又灵敏，操作快速简便，不再受操作者和设备的限制，有助于CD的治疗和预防。
我们开发了一种便携式的RAA-CRISPR-Cas13a检测方法，用于CDV RNA检测，整合了HUDSON技术（加热未提取的诊断样本以灭活核酸酶），可在1.5小时内使用qPCR仪器或侧向流动条带获得结果，提供了前所未有的速度、灵敏度和操作灵活性。这种方法在资源有限的环境或极端天气条件下尤其有价值，因为传统诊断方法在这种情况下不方便使用。
章节片段
病毒和临床样本
我们在实验室中分离并保存了犬瘟热病毒（CDV）株、chaphamaparvoviruses（ChPV）株（Li等人，2023年）、犬疱疹病毒（CHV）株和犬冠状病毒（CCoV）株。疫苗株经典犬腺病毒-2（CAV-2）和犬副流感病毒（CPIV）购自美国林肯市的Zoetis公司。从中国哈尔滨的不同兽医医院收集了20份组织样本（Chang等人，2020年）。结合CRISPR-Cas13a的侧向流动条带检测
对于侧向流动检测（LFD），在poly U的5’端标记FAM，在poly U的3’端标记生物素，形成FAM-RNA-生物素报告基因。对于阴性样本，测试条带的抗FAM抗体与FAM-RNA-生物素完全结合，结合物被Control（C）线上的生物素配体捕获。在阳性样本反应中，Cas13a切割了报告RNA，金颗粒、抗FAM抗体和FAM结合物积累在讨论
自从发现CDV感染近三个世纪以来，由于其高传染性和死亡率，这种病毒对宠物、毛皮经济动物和野生动物构成了全球性威胁。最近的研究表明，其宿主范围正在扩大，对社会经济稳定性和公共卫生的风险也在增加（Karki等人，2022年；Uhl等人，2019年）。为了抑制病毒传播并减少损害，检测病毒是关键环节。
结论
总之，我们开发并验证了一种快速、灵敏的RAA-CRISPR-Cas13a平台，用于CDV检测，可在1.5小时内实现无需仪器的诊断，并与RT-PCR保持100%的一致性。该系统结合了等温扩增和CRISPR-Cas13a的特异性，能够检测到1.6×102拷贝/μL的CDV cDNA质粒，并区分其他犬类病原体。仍有许多有意义的改进方向
伦理声明
动物研究得到了东北农业大学机构委员会的批准。研究符合当地法规和机构要求。科学写作中生成AI的声明
作者声明在写作过程中未使用AI和AI辅助技术。CRediT作者贡献声明
姜玉轩：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，概念构思。杨在兴：软件，方法学，研究。杨佳梅：软件，研究，数据管理。李一凡：可视化，方法学，研究。刘家琪：可视化，方法学。赵莉莉：项目管理，资金获取，概念构思。葛俊伟：写作 – 审稿与编辑，验证，监督，资金获取，概念构思。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢
作者衷心感谢国家重点研发计划（2021YFF0703000）、中央政府指导地方科技发展专项资金（ZY25JD15）以及东北农业大学的SIPT项目（S202410224051）的财政支持。图形摘要图由BioGDP.com制作。
