基于分区骨软骨外植体模型的MSC分泌组抗炎及抗分解代谢作用评估

《Stem Cells International》：Evaluation of MSC-Secretome Effects in an Ex Vivo Compartmentalized Osteochondral Interface Model

本研究开发了一种新型体外分区骨软骨（OCh）模型，通过3D打印装置实现骨与软骨组织的物理分离，并评估了脂肪来源间充质干细胞分泌组（CM/pCM）在炎症刺激下对软骨的保护作用。结果显示CM/pCM能显著抑制基质金属蛋白酶（MMP）活性，展现出抗分解代谢潜力，为骨关节炎（OA）的细胞无治疗策略提供了实验依据。

　　

1. 1.
   引言

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种慢性、致残性关节疾病，以关节软骨进行性降解、软骨下骨重塑和滑膜炎症为特征。OA影响全球数百万人，给医疗系统带来显著社会经济负担，并严重影响患者生活质量。当前治疗方法主要侧重于症状缓解，而疾病修饰疗法仍在开发中。OA日益增长的患病率凸显了对针对软骨降解和关节退变潜在机制的早期创新策略的迫切需求。

传统体外OA模型通常采用单层培养的关节软骨细胞，为OA发生和发展的分子通路提供了宝贵见解。然而，二维细胞培养缺乏天然细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM），这是研究关节微环境中复杂相互作用时的关键组成部分。此外，由于OA是全关节疾病，必须在每个受影响组织中研究其分子和病理过程。相比之下，来自人或动物关节的骨软骨（Osteochondral, OCh）外植体保留了天然组织的结构完整性，从而为骨科研究提供了更具生理相关性的模型。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem/Stromal Cells, MSCs）已成为OA管理的有希望的候选者。它们的治疗潜力主要归因于其免疫调节特性和再生能力。作为无细胞替代方案，MSC衍生的分泌组（包括条件培养基（Conditioned Medium, CM）和细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs））正受到关注。这些产品含有生物活性分子，如生长因子、细胞因子、脂质和microRNA，可调节炎症并促进组织修复。MSC研究的最新进展探索了启动或预处理策略，以增强其分泌组的治疗潜力。

本研究采用改进的实验装置，其特点是定制设计的双室装置。该装置物理分离软骨和骨室，将它们之间的相互作用限制在OCh界面。该系统能够实现区室特异性培养条件，并允许将炎症刺激和治疗靶向应用于软骨侧，有效模拟发炎的滑膜环境和模仿关节内治疗给药。在此背景下，探索了脂肪来源MSC（Adipose-derived MSC, ASC）分泌组，特别是CM和启动CM（primed CM, pCM）作为组织修复和炎症调节的候选工具的潜力。

1. 2.
   材料与方法

2.1. OCh外植体的获取

OCh外植体是在获得参与ASC-OA研究（临床试验政府标识符：NCT04223622）的参与者知情同意后获得的。仅Kellgren-Lawrence III级患者纳入本研究。使用环钻从膝关节置换术中的胫骨平台和股骨髁的宏观保存区域提取外植体。

2.2. ASC培养及CM和pCM的制备

研究中使用的ASC来自2015年至2023年间冷冻保存的批次。细胞最初从接受美容或假体手术患者皮下脂肪废组织中分离。CM和pCM的生产如下：汇合度80%–90%的ASC，未经处理或经10 ng/mL TNFα和10 ng/mL IL-1β处理5分钟，在无血清条件下培养3天。

2.3. 3D插入物设计

研究使用了定制插入物，通过计算机辅助设计（Computer Assisted Design, CAD）软件设计，并采用使用数字光处理（Digital Light Processing, DLP）技术的Asiga Max x3D打印机打印。

2.4. CM和pCM的表征

作为表征过程的一部分，评估了产品的颗粒和蛋白质含量。使用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）评估CM颗粒的浓度和尺寸分布。使用 Bradford 测定法评估总蛋白质含量。使用流式细胞仪进行细胞荧光分析。使用定制的Human Premixed Multi-Analyte Kit LXSAHM评估了14种分析物（包括免疫调节细胞因子、趋化因子和生长因子）的水平。

2.5. 实验设计

OCh外植体在12孔板中适应1周后，置于定制分隔器内，并随机分配到四组之一：对照组（CTR）、细胞因子攻击组（TNF + IL）、细胞因子攻击加CM处理组（TNF + IL + CM）、细胞因子攻击加pCM处理组（TNF + IL + pCM）。软骨特异性培养基和骨侧培养基成分不同。炎症刺激使用10 ng/mL TNFα和1 ng/mL IL-1β应用于软骨侧，而CM和pCM剂量来自5 × 10⁵个ASCs。

2.6. 组织活力分析

在干预前，使用AlamarBlue测定法评估每个OCh外植体的活力。在第3天重复相同的活力评估以监测随时间的变化。

2.7. 基质金属蛋白酶（MMP）活性评估

使用SensoLyte 520 Generic MMP Activity Kit评估MMPs的活性。

2.8. 释放的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）测量

使用二甲亚甲蓝（Dimethyl-methylene Blue, DMMB）法量化培养上清液中sGAGs的释放。

2.9. 骨钙素（Osteocalcin, OC）定量

使用人骨钙素Simple Step ELISA Kit定量OC水平。

2.10. 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）活性评估

通过比色法评估ALP活性，利用底物对硝基苯磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate, pNPP）转化为其黄色产物对硝基苯酚（p-nitrophenol, pNP）。

2.11. 抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP）活性分析

使用比色法评估TRAP的酶活性。

2.12. MMP3和COL2A1蛋白表达分析

通过蛋白质印迹（Western Blotting）分析MMP3和II型胶原α1链（Collagen Type II Alpha 1 Chain, COL2A1）的蛋白表达。

2.13. 统计分析

使用GraphPad Prism（版本10.4.1）进行统计分析。

1. 3.
   结果

3.1. OCh模型外植体活力及区室完整性的验证

OCh外植体在采集后总共培养10天，在实验时间点第0天（适应期后）和实验结束时（第3天）进行活力评估。在软骨和骨组织中均检测到代谢活性，但程度显著不同。关于组织标志物，选择MMP活性和sGAG水平用于软骨区室，ALP和TRAP活性以及OC水平作为骨标志物进行分析。结果证实了清晰的区室分离，具有 distinct 的组织特异性标志物水平，表明该模型可作为双室系统工作而无泄漏，并且培养基配方保持了每个区室的天然特性而未改变相邻区室的生理状态。

3.2. CM和pCM的表征

CM和pCM样品在施用于软骨区室前进行了经典表征。NTA显示，CM和pCM的颗粒分布在相同尺寸范围内出现峰值，但pCM表现出更高的峰值。实际上，pCM中的颗粒浓度显著增加。总蛋白质定量在pCM样品中也显著更高。随后，通过流式细胞术评估EV的存在及其质量作为必要的对照。CM和pCM同样显示对CD63和CD81强阳性，对CD9阳性较弱。最后，量化了CM和pCM中14种生物活性因子的水平。所有分析物均可检测到，证实两种制剂均含有参与关键生物过程的因子，如免疫调节、对炎症刺激的细胞反应和细胞分解代谢调节。值得注意的是，大多数分析物的浓度在pCM中高于CM，特别是CCL2、CCL3、CXCL1、G-CSF、HGF、IL-1ra、IL-8和VEGF-A的浓度增加显著。

3.3. CM和pCM对细胞因子攻击的外植体的作用

在验证实验设置的稳健性后，研究的第二部分旨在评估CM和pCM对细胞因子攻击的OCh外植体的作用。炎症刺激涉及OA相关细胞因子，并且细胞因子和CM/pCM处理仅施用于软骨区室。在整个实验过程中进行的活力评估显示，无论实验组如何，软骨区室的活力随时间下降。相比之下，骨区室的活力在3天内保持相当稳定。在软骨区室中，细胞因子刺激产生MMP活性的显著增加（+345%），这是软骨降解的标志。然而，用CM处理，以及更有效地，用pCM处理减轻了这种增加，分别使MMP活性相对于TNF + IL组降低了-60%和-84%。有趣的是，MMP3蛋白表达的评估表明，尽管炎症细胞因子在转录/翻译水平诱导了增加，但CM和pCM的作用是下游的。sGAG水平显示在所有暴露于细胞因子的组中与CTR相比均有所增加（TNF + IL组+59%，TNF + IL + CM组+43%，TNF + IL + pCM组+47%）。最后，COL2A1的蛋白表达进一步支持了观察到的趋势。在骨侧，OCh外植体在ALP和TRAP活性以及OC释放方面未表现出任何显著调节。

1. 4.
   讨论

改进的体外模型对于揭示OA进展中骨与软骨之间复杂的相互作用至关重要。在这些新兴策略中，基于MSC的疗法为OA管理提供了一条有希望的途径，无细胞替代方案通过解决细胞移植固有的挑战代表了范式转变。我们的方法整合了在OCh外植体培养物中空间分离骨和软骨的定制装置，重现了生理关节界面。在将模型应用于实验设置之前，我们在3天后验证了适当区室内组织特异性标志物的存在。这使我们能够确认区室的有效分离和不存在交叉污染。活力评估显示，虽然骨区室在3天内保持稳定，但软骨代谢在第3天显示出显著降低。在我们的模型中，软骨对具有OA典型细胞因子的炎症刺激有反应，显示出组织特异性标志物的显著调节。

在骨侧，ALP活性以及在更小程度上的OC浓度，仅在软骨炎症暴露后显示出下降趋势。此外，预计会因炎症刺激而增加的TRAP活性并未被独特地调节。骨标志物缺乏改变，尽管在软骨区室中观察到炎症反应，这可能表明在当前实验条件下组织间通讯未有效建立。

在这项研究中，我们利用OCh模型评估CM和pCM对抗炎症刺激的作用。CM和pCM处理对软骨区室产生了MMP活性的抗分解代谢作用，而未改变细胞因子诱导的MMP3表达。这表明CM的下游作用，而不是转录/翻译调节作用。处理未改变细胞因子增加的sGAGs释放水平。关于COL2A1蛋白表达，其他研究表明CM不负责其翻译调节，并且在炎症环境存在下，软骨基质沉积受到强烈抑制。

尽管存在不同的结果，离体人模型具有显著优势，能紧密重现体内环境，使其在临床转化前评估病理表型和治疗疗效的最相关工具之一。

1. 5.
   结论

OA是全球增长最快的肌肉骨骼疾病之一，具有巨大的经济和社会负担，并且由于人口老龄化预计将进一步升级。在这种情况下，开发创新、有效和安全的治疗策略至关重要。无细胞方法，特别是基于间充质细胞衍生物的方法，正在成为治疗受影响关节和减轻OA相关症状的可行且有希望的工具，而无需面对细胞疗法相关的复杂性。在这项研究中，我们旨在实施一种离体分区骨软骨界面模型，这是软骨和骨之间相互作用的关键部位，也是OA相关损伤的主要目标。双室模型允许局部施用炎症刺激，并同时在软骨侧应用我们的无细胞治疗剂：来自天然或炎症细胞因子攻击的脂肪来源间充质干细胞的分泌组。两种处理都显示出强大的抗分解代谢潜力，阻碍了软骨水平的MMP活性。鉴于在这种情况下pCM疗效缺乏改善，探索替代启动策略可能是必要的。总之，我们的研究结果应在OA无细胞策略持续研究的更广泛背景下进行解释。通过证明这种优化的离体平台的适用性，这项工作有助于推进OA的转化研究，并为在再生医学中研究基于分泌组的无细胞治疗方法提供了额外的理论依据。