《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Convergent Multistage Evidence Implicates the CCR2–Artemin Immune–Inflammation Axis in Acute Myeloid Leukemia
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本文通过多阶段孟德尔随机化（MR）、中介分析和实验验证，系统揭示了免疫细胞表型与血液恶性肿瘤的因果关联，重点发现CCR2在CD62L+髓系树突状细胞上的表达与急性髓系白血病（AML）风险呈负相关，且Artemin（ARTN）介导了这一保护效应。研究整合了遗传学、蛋白质组学和功能实验证据，提出了CCR2–ARTN免疫炎症轴作为AML潜在治疗靶点，为血液肿瘤的免疫干预提供了新视角。
1. 引言
血液恶性肿瘤是一组起源于骨髓和淋巴系统造血组织的异质性癌症，包括急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等。尽管化疗、靶向药物和移植技术取得进展，但临床和分子异质性仍是实现持久治愈的主要障碍，亟需阐明免疫系统在疾病起始和进展中的作用机制。观察性和实验研究表明，特定免疫细胞表型及其细胞因子输出可促进或抑制肿瘤发展，但此类证据易受混杂和反向因果关系影响，且难以确定循环蛋白是否介导免疫至癌症的效应。
为填补这一空白，本研究预设了一个多阶段工作流程：采用两样本和多变量孟德尔随机化（MR）分析731种免疫性状与12种血液癌症的关联；通过两步中介MR评估91种循环炎症蛋白的介导作用；利用MAGMA/FUMA进行基因和通路富集分析；并在英国生物样本库（UK Biobank）中使用性状特异性遗传风险评分（GRS）进行外部验证。随后，在人类单核白血病细胞系（THP-1）和永生化骨髓源性巨噬细胞（IBMDM）中进行CCR2扰动实验，检测Artemin（ARTN）mRNA表达变化，并使用Olink炎症面板分析ARTN的蛋白质组学相关性。
2. 材料与方法
2.1. 研究设计
本研究遵循预设的、逐步推进的工作流程，将免疫细胞表型与血液恶性肿瘤联系起来，并从发现走向生物学优先排序。首先，我们进行两样本MR，筛选免疫性状对12种血液恶性肿瘤的因果效应。其次，对于受多种免疫性状影响的结果，我们应用多变量MR（MVMR）来估计独立效应。第三，我们通过91种循环炎症蛋白的中介MR评估间接通路。第四，我们使用基于MAGMA的基因和通路分析来背景化所涉及的生物学。第五，我们在UK Biobank中通过测试性状特异性GRS进行外部验证。最后，在汇聚证据的指导下，我们进行了靶向细胞实验，以探索AML中优先考虑的CCR2–ARTN轴。
2.2. 数据集
我们从GWAS目录中获得了731种免疫表型的汇总统计数据，这些性状包括绝对细胞计数（AC）、相对细胞计数（RC）、反映表面抗原水平的 median 荧光强度（MFI）和形态学参数（MP），涵盖了B细胞、树突状细胞（DCs）、不同成熟阶段的T细胞、单核细胞、髓系细胞等。12种血液恶性肿瘤终点的汇总统计数据来自UK Biobank和FinnGen的荟萃分析。91种循环炎症蛋白的血浆蛋白质组学数据来自一项大型pQTL荟萃分析。
2.3. 工具变量选择
对于每种免疫性状，我们选择p < 1×10?5的SNP作为工具变量，并使用PLINK进行连锁不平衡（LD）聚类。估计方差解释度（R2）和第一阶段F统计量以评估工具强度，保留F > 10的工具集以限制弱工具偏倚。
2.4. MR分析
我们使用逆方差加权（IVW）MR作为免疫性状对血液恶性肿瘤因果效应的主要估计量。使用错误发现率（FDR）控制多重检验。进行了多种敏感性分析以确保结果的稳健性，包括异质性检验、MR-Egger回归、加权中位数/加权模式方法、MR-PRESSO异常值校正、单SNP分析和留一法分析。
2.5. 多变量MR和中介分析
对于在单变量MR中显示有因果证据的多种免疫性状，我们使用IVW进行MVMR以估计相互调整后的效应。为了测试循环炎症蛋白是否介导免疫至癌症的效应，我们使用汇总统计数据实施了两步中介MR。间接效应（IDE）计算为系数乘积（a×b）。
2.6. 因果免疫细胞的生物学作用和通路分析
我们对八种已识别的因果免疫细胞类型进行了MAGMA基因集分析，以确定候选多效性基因。随后，我们对映射的关键基因进行了组织特异性和通路分析。使用FUMA进行生物学功能注释，并使用Metascape工具整合Gene Ontology（GO）、KEGG、WikiPathways（WP）和细胞特异性基因集数据库进行通路分析。
2.7. UK Biobank中的外部验证
为了外部验证MR识别的免疫性状的生物学相关性，我们使用免疫表型GWAS的领先SNP构建了八种免疫细胞表型的GRS。然后评估每个GRS与事件性血液恶性肿瘤的关联。
2.8. CCR2介导的ARTN表达调控的功能验证
我们的实验测试了CCR2扰动是否在具有稳健CCR2表达的髓系系统中定向调节ARTN转录。选择了人单核白血病细胞系（THP-1）和小鼠永生化骨髓源性巨噬细胞（IBMDM）用于实验。采用了两种策略：药理抑制（使用CCR2拮抗剂）和siRNA介导的敲低。
3. 结果
3.1. 免疫细胞表型与血液恶性肿瘤的因果关联
在731种免疫表型和12种血液恶性肿瘤中，两样本MR识别出八种达到FDR显著性阈值的免疫性状。在AML中，过渡性B细胞上的BAFF-R和CD19与风险呈正相关，而CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2与风险呈负相关。在HL和CML等疾病中也发现了显著的关联。MVMR分析显示，在AML中，过渡性B细胞上的BAFF-R、CD19以及CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2在相互调整后仍保持显著独立关联。
3.2. 循环炎症蛋白的中介作用
在八种显著的免疫-恶性肿瘤关联中，对91种循环炎症蛋白的中介分析揭示ARTN是连接免疫细胞信号传导至AML风险的关键下游效应物。对于AML，CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2通过ARTN水平显示出保护性的间接效应，而过渡性B细胞上的CD19通过ARTN赋予风险增强的间接效应。
3.3. 大型前瞻性队列中的外部验证
为了验证MR和中介分析提示的因果结构，在UK Biobank队列中构建了性状特异性GRS。结果一致地复制了预测的方向。对于AML，代表过渡性B细胞上CD19表达的GRS与较高风险相关，而代表CD62L+髓系树突状细胞上CCR2表达的GRS与较低风险相关。
3.4. CCR2–ARTN调控轴的实验验证
在IBMDM和THP-1模型中，两种独立的CCR2 siRNA敲低或药理抑制CCR2均能有效降低CCR2蛋白和mRNA水平，并伴随ARTN mRNA表达的一致增加，这为CCR2→ARTN的负向调控关系提供了功能支持。
3.5. 生物学通路和基因集分析
基因水平关联（MAGMA）分析识别出129个多效性基因。组织表达富集分析提示这些基因在全血和脾脏中富集。整合的通路分析突出了外部质膜侧、16p11.2远端缺失综合征和IgG结合等通路。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）模块强调了趋化因子受体（CCR1/CCR2/CCR3/CCR5）和Fcγ受体节点（FCGR2A/FCGR2B）。
4. 讨论
本研究通过整合MR、中介分析、通路注释、GRS验证和靶向细胞实验，揭示了一条免疫炎症通路：CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2与AML风险呈负相关，ARTN作为下游介质参与其中。在单核/巨噬细胞系统中的CCR2扰动伴随着ARTN转录水平的变化，为CCR2-ARTN耦合提供了功能支持。BAFF、CD19、CD27等已知免疫调节剂的作用在本研究的MR分析中得到重现，验证了分析框架的可靠性。此外，研究还识别了CD24、CD38、HLA-DR在血液恶性肿瘤中的新作用。本研究的关键发现在于将CCR2-ARTN识别为一个先前未被认识的免疫调节和代谢信号轴。独立基因组学和转录组学证据将CCR2定位为跨血液学环境的可成药和可监测节点。ARTN从我们的分析流程中显现，作为连接免疫细胞性状与AML风险的独特、连贯的介质。
5. 局限性
本研究存在若干局限性，包括残留多效性的可能性、中介分析所依赖的蛋白质组平台特异性、表型异质性、人群特异性、功能实验模型与原发性CD62L+髓系树突状细胞的差异等。实验证据应被视为方向性提示，需要在原发性CD62L+树突状细胞中进行正交验证。
6. 结论
通过多证据整合，我们描绘了一条免疫炎症通路，其中CD62L+髓系树突状细胞上的CCR2与AML风险呈负相关，ARTN作为下游介质参与。CCR2扰动实验支持了CCR2-ARTN耦合。这些数据与CCR2信号传导有助于维持抗白血病微环境的观点一致，而ARTN则将免疫变异与髓系背景下的生存通路联系起来。提出了两个互补的治疗方向值得在临床前模型中评估：增强免疫区室中的CCR2功能以及拦截活跃的RET/ARTN信号传导。CCR2和循环ARTN可作为早期研究中的探索性药效学读数。所有因果推断均基于MR假设，需通过统计共定位、机制实验和体内模型确认。
