《International Journal of Genomics》：IER3 Promotes Malignant Progression of Colorectal Cancer Through the NF-κB Pathway
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本文揭示了应激应答基因IER3在结直肠癌（CRC）中的关键作用：通过单细胞测序发现IER3+恶性细胞亚群与不良预后相关；功能实验证实IER3通过激活TNF-α/NF-κB通路增强肿瘤增殖侵袭能力，并经由FN1-CD44轴重塑免疫抑制微环境；临床分析表明IER3高表达患者对免疫检查点阻断（ICB）疗法反应更差。该研究为CRC的靶向治疗和免疫联合策略提供了新靶点。
Abstract
结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其高死亡率主要归因于转移性进展和免疫抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）。应激应答基因IER3在多种癌症中表达失调，但其在CRC发病机制和免疫调节中的功能作用尚不明确。本研究通过临床样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，发现了一个与侵袭性疾病和不良预后相关的独特IER3表达恶性亚群。功能研究表明，IER3在体外和体内均能驱动CRC的增殖、侵袭和转移能力。机制上，IER3激活TNF-α/NF-κB信号通路，从而增强RELA/p65的表达和磷酸化。此外，IER3+恶性细胞通过改变免疫细胞浸润和促进FN1-CD44轴的通讯，将TIME重塑为免疫抑制状态。高IER3表达与免疫检查点阻断（ICB）反应降低和不同的药物敏感性相关。这些结果证实了IER3是CRC进展和免疫逃逸的双重关键介质，凸显了其作为个性化治疗策略的潜在治疗靶点和生物标志物。
1. Introduction
结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因。其不良预后主要归因于肝转移的高发生率。因此，阐明驱动CRC进展的生物学机制、识别预测性生物标志物和发现新的治疗靶点是当前研究的主要挑战。越来越多的证据表明，CRC的肿瘤免疫微环境具有明显的免疫抑制特征，其特征是免疫抑制细胞群扩增，同时CD8+T细胞和NK细胞的浸润减少和细胞毒性受损，共同导致免疫监视功能受损。尽管这些研究概述了CRC的免疫抑制特征，但负责TIME重塑的具体恶性亚克隆及其机制仍不清楚。应激应答基因即时早期反应3（IER3）在多种人类癌症中显著失调，并在调节细胞周期进程、分化和存活中表现出多效性、环境依赖性作用。然而，由于其双重功能，IER3在肿瘤进展、免疫逃避和临床结果中的确切作用仍存在争议。新出现的单细胞数据表明IER3+恶性细胞与CRC不良预后相关；然而，IER3是否通过NF-κB信号和/或免疫调节机制促进CRC进展尚不清楚。为了研究CRC进展的分子基础，我们对16例接受手术切除的初治CRC患者的26个样本（11个正常组织和15个原发性肿瘤）进行了单细胞RNA测序。尽管关于IER3在CRC中的生物学作用存在相当大争议，有证据支持其肿瘤抑制和致癌功能，但本研究试图解决这一差异。我们的综合分析揭示了原发性和转移性病变之间的显著异质性，确定了以IER3表达为特征的不同侵袭性恶性亚群。通过严格的临床验证和体外体内功能测定，我们确定IER3是CRC增殖、侵袭和疾病进展的关键调节因子。关键的是，我们发现IER3+恶性细胞和免疫细胞之间的串扰驱动TIME重塑为免疫抑制状态，从而促进免疫逃逸。我们的研究结果不仅证实了IER3在CRC中的促肿瘤作用，而且通过描绘其在侵袭性疾病亚群的免疫景观中的特定环境依赖性功能，为其争议性质提供了机制基础。这项工作将IER3定位为潜在的治疗靶点，并为改进CRC中的免疫检查点阻断（ICB）策略提供了新的见解。
2. Materials and Methods
本研究获得了山西医科大学第一医院伦理委员会的伦理批准，并获得了所有参与者的书面同意。我们从四名被诊断为CRC的个体中获取了15个组织标本，包括匹配的正常粘膜、息肉组织、原发性癌和肝转移性病变。还从84名受试者中检索了存档的石蜡包埋组织块，包括14个结直肠肝转移、84个原发性CRC标本、26个结直肠息肉和36个正常结直肠粘膜样本。通过回顾性分析医疗记录和与患者的结构化访谈，系统地记录了人口统计学和临床参数。单细胞分离、测序、数据处理、拷贝数变异（CNV）分析、基因本体论（GO）富集分析、通路富集分析、基因集富集分析（GSEA）、伪时间轨迹分析、细胞干性评估、分子信号通讯分析、免疫浸润分析、免疫组织化学（IHC）、细胞系培养、CCK-8增殖试验、集落形成试验、Transwell试验、裸鼠皮下肿瘤形成、条件培养基制备、酶联免疫吸附试验（ELISA）和统计分析均按照标准方案进行。
3. Results
3.1. The Association Between IER3 Expression and the Clinical Characteristics of CRC
泛癌分析显示IER3在包括CRC在内的多种癌症类型中显著上调。使用TCGA和GEPIA数据集初步验证了IER3在CRC肿瘤中相对于正常组织的过表达。120个临床标本（36个正常和84个原发性CRC）的免疫组织化学（IHC）分析证实，与正常粘膜相比，原发性CRC病变中的IER3蛋白水平显著升高。高IER3表达与不良的临床病理特征显著相关，包括M1分期、神经周围浸润、低分化和血清癌胚抗原（CEA）水平升高。关键的是，Kaplan-Meier生存分析表明，高IER3表达的患者总生存期显著缩短。这些数据表明IER3是促进CRC进展的一个因素，促进肿瘤进展并预测不良临床结果。
3.2. Identification of an IER3-Expressing Malignant Cell Subtype Associated With Poor Prognosis in CRC at Single-Cell Resolution
为了在单细胞分辨率下表征CRC，我们对从16名初治CRC患者收集的样本进行了scRNA-seq。该数据集包括11个正常结肠粘膜和15个原发性肿瘤标本；UMAP图说明了样本来源和质量控制程序。经过质量控制过滤（线粒体基因含量<0.4%；每个细胞200-10000个基因）后，保留了26个样本的78,377个高质量细胞用于下游分析。基于PCA的无监督聚类识别出28个主要簇，并使用均匀流形近似和投影（UMAP）进行可视化。细胞被注释为10个不同的谱系：T/NK细胞（CCL5, CD3E, CD3D, PTPRC）、B细胞（MS4A1, CD79A, CD19）、浆细胞（IGHM, JCHAIN）、髓系细胞（C1QA, VCAN, LYZ）、中性粒细胞（FCGR3B, CSF3R, S100A9）、肥大细胞（TPSB2, TPSAB1, CPA3）、内皮细胞（CLDN5, VWF, PECAM1）、上皮细胞（KRT8, CD24, EPCAM）和成纤维细胞（TAGLN, COL1A1, DCN）。比较分析显示，与正常粘膜相比，肿瘤组织中的B淋巴细胞和浆细胞丰度降低。相反，中性粒细胞、髓系细胞和内皮细胞在CRC样本中显著富集，强调了肿瘤微环境（TME）在恶性进展过程中的重塑。鉴于上皮细胞在肿瘤发生和发展中的关键作用，对其进行了进一步的亚聚类。使用正常上皮细胞作为参考，通过推断性CNV分析鉴定了推定的恶性细胞。基于CNV谱对恶性上皮细胞进行分层，并根据簇定义的基因表达特征进行注释，产生了六个不同的亚群，并使用UMAP进行可视化。我们接下来评估了IER3在上皮亚群中的表达，并观察到在恶性簇中显著上调。定量比较证实了肿瘤细胞中IER3表达显著高于正常上皮细胞。将IER3表达在前25%的细胞分类为IER3_High_malignant，其余为IER3_Low_malignant。IER3_High_malignant亚组表现出比IER3_Low_malignant亚组显著更高的恶性潜能。一致地，TCGA CRC队列分析显示，富含IER3_High_malignant亚型的患者总生存期显著缩短。
3.3. Characterization of the IER3-Expressing Malignant Subtype in CRC
我们接下来使用CytoTRACE推断细胞分化状态，并应用Monocle 3重建恶性上皮细胞的发育轨迹。轨迹推断提示进展起源于IER3_Low_malignant细胞并向IER3_High_malignant细胞推进。我们进一步评估了与IER3_High_malignant亚群相关的关键基因在伪时间上的表达动态，并观察到IER3、CCL20和FN1逐渐增加。差异基因表达分析确定了IER3_High_malignant细胞与IER3_Low_malignant细胞相比有487个上调基因和1523个下调基因。GO富集分析表明上调基因在与上皮细胞增殖相关的生物过程中显著富集。KEGG通路分析显示在几个致癌信号通路中显著富集，包括NF-κB信号、ErbB信号、IL-17信号和TNF信号。GSEA进一步证实了TNF-α/NF-κB信号通路在IER3_High_malignant细胞中的显著激活。这些发现表明IER3_High_malignant亚型通过免疫调节和炎症信号通路的协同失调促进CRC进展。
3.4. IER3 Promotes Tumor Growth and Invasion In Vitro and In Vivo
qPCR分析显示，与正常结肠上皮细胞（NCM460）相比，CRC细胞系（SW480、SW620、HCT116）中IER3 mRNA表达显著升高。通过慢病毒转导在HCT116和SW480细胞中产生稳定的IER3敲低和IER3过表达细胞系，并通过免疫印迹证实了有效的调控。CCK-8试验显示IER3敲低抑制细胞增殖，而IER3过表达增强细胞活力。与这些发现一致，IER3耗竭后集落形成能力降低，但IER3过表达后增加。Transwell迁移和侵袭试验进一步证明IER3敲低损害迁移和侵袭能力，而IER3过表达促进这两种活动。在体内，来自IER3过表达细胞的异种移植肿瘤表现出加速生长和更大的肿瘤体积，而IER3敲低导致裸鼠的致瘤性显著降低。
3.5. IER3 Activates TNF-α/NF-κB Signaling
使用GSEA对TCGA队列的分析表明，在IER3表达升高的CRC患者中，Hallmark TNF-α/NF-κB信号通路显著富集。共表达分析揭示了IER3水平与TNF-α和RELA/p65亚基表达之间的显著正相关。ELISA显示肿瘤细胞中IER3敲低降低了TNF-α蛋白分泌，而IER3过表达相对于对照显著增加了TNF-α分泌。在用重组TNF-α蛋白补充肿瘤细胞培养物以外源性刺激NF-κB通路后，对关键通路成分RELA/p65的分析显示，IER3耗竭显著抑制了RELA/p65蛋白表达和p-p65（Ser536）水平。相反，IER3过表达显著增强了RELA/p65蛋白表达和p-p65（Ser536）水平。这些数据表明IER3可能通过上调TNF-α来增强RELA/p65转录活性，从而促进RELA/p65蛋白表达并增强Ser536磷酸化，激活NF-κB信号级联。这种机制将IER3阳性状态与观察到的转移倾向增加联系起来。为了确定IER3驱动的恶性表型对NF-κB通路活性的依赖性，用NF-κB抑制剂PDTC处理IER3过表达的CRC细胞。值得注意的是，PDTC在CCK-8和集落形成试验中消除了IER3诱导的增殖优势，并类似地否定了在Transwell试验中观察到的增强的迁移和侵袭能力。这些功能拯救数据证明TNF-α/NF-κB信号是IER3增强肿瘤进展的主要通道。
3.6. IER3 Expression Modulates Immune Landscape and Dictates Therapeutic Response in CRC
为了评估IER3高与IER3低表达CRC中的免疫浸润程度并绘制免疫细胞图谱，我们使用CIBERSORT进行反卷积分析。小提琴图揭示了IER3高和IER3低组之间多种免疫细胞类型（22个亚群）丰度的显著差异。相关性分析表明IER3表达与肥大细胞丰度呈正相关，但与NK细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞呈显著负相关。免疫检查点分子表达分析确定了两个在IER3高组中显著上调的检查点（CD276和TNFRSF4），而三个（HAVCR2、BTLA和CD40LG）下调。一致地，IER3表达与CD276和TNFRSF4呈正相关，与HAVCR2、BTLA、CD40LG和CD28呈负相关。为了预测对免疫疗法的反应，我们应用了TIDE算法。升高的TIDE分数与ICB疗效降低相关。值得注意的是，在我们的研究中，IER3高组显示出比IER3低组显著更高的TIDE分数，表明高IER3表达可能阻碍ICB疗效。使用oncoPredict进行的药物敏感性分析显示，IER3高组对六种药物（Ribociclib, AZD4547, OF-1, Ribociclib.1, AZD4547.1, OF-1-1）表现出更高的敏感性，而IER3低组对四种药物（Dasatinib, ERK_2440, Dasatinib.1, ERK_2440.1）更敏感。
3.7. Dominant FN1-CD44 Axis Mediates IER3+Malignant-to-Immune Communication in CRC
为了定义和理解复杂的生物学相互作用，我们使用CellChat分析了CRC微环境中的细胞-细胞通讯网络。初步分析侧重于IER3_High_malignant细胞亚群作为信号源。我们观察到IER3_High_malignant细胞与多种免疫细胞类型之间存在强大的通讯概率。随后的分析使用热图揭示了跨细胞类型的传出和传入信号模式的显著差异。IER3_High_malignant亚群在特定的传出通路中表现出显著高的活性，包括FN1、GALECTIN和GDF信号。在FN1信号网络内，IER3_High_malignant细胞作为主要的信号发送者，免疫细胞作为主要接收者。分层可视化描绘了由FN1介导的特定细胞间连接，确定了源自IER3_High_malignant细胞靶向CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和肥大细胞的突出信号相互作用。为了解析这种通讯背后的精确配体-受体相互作用，我们绘制了相互作用组。气泡图分析表明，从IER3_High_malignant细胞到免疫细胞（CD4+T, CD8+T, NK, 肥大）的信号传导主要由FN1-CD44配体-受体对介导。FN1-CD44轴是FN1信号通路整体强度的主要贡献者。支持这一点，小提琴图证实配体FN1在IER3_High_malignant亚群中特异性高表达，而同类受体CD44在免疫细胞中表达升高。最后，通过ELISA进行的功能验证表明，肿瘤细胞中IER3过表达显著增强了CRC细胞系（SW480和HCT116）中FN1蛋白的分泌。这种增加通过与NF-κB通路抑制剂PDTC共同处理而逆转。
4. Discussion
综合IHC、单细胞转录组、功能验证和临床相关性分析阐明了CRC的进展，并确定IER3是通过激活TNF-α/NF-κB信号通路驱动CRC进展的关键驱动因子。此外，在肿瘤免疫景观中，IER3+恶性细胞通过FN1-CD44轴重塑TIME并促进免疫逃逸，从而加速疾病进展。高IER3表达患者表现出更差的临床结果和对ICB的反应降低。通过单细胞转录组分析，本研究在CRC中表征了一个IER3_High恶性亚群。该亚群不仅与升高的基因组不稳定性（包括增加的拷贝数改变和更高的增殖能力）相关，而且与显著更差的患者预后相关。轨迹推断分析表明IER3_High恶性细胞可能代表从IER3_Low恶性群体衍生的终末进化状态，在肿瘤发展过程中逐渐获得。功能上，该亚型通过协同激活多个致癌和炎症通路，包括NF-κB、TNF和IL-17信号，有助于TIME重塑和肿瘤进展。我们阐明了IER3促肿瘤功能的机制基础。TNF-α/NF-κB通路在肿瘤学研究中已充分确立，可驱动结直肠癌发生、促进侵袭、转移和血管生成，并诱导治疗抵抗。我们的scRNA-seq数据和TCGA队列的GSEA均表明IER3激活TNF-α/NF-κB信号以促进CRC中的恶性表型，这一发现通过PDTC介导的拯救实验得到证实。关于肿瘤免疫学，IER3高表达与肥大细胞浸润呈正相关，但与NK细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞呈负相关。FN1-CD44信号轴已成为IER3+恶性细胞和免疫细胞之间细胞间通讯的主要介质。激活的肥大细胞可阻碍T细胞活化，诱导免疫耐受，并分泌促血管生成因子（如VEGF），加速新血管形成并促进肿瘤侵袭和转移。CD8+T细胞和NK细胞浸润减少和功能受损削弱了免疫监视，有利于免疫逃逸和持续肿瘤进展。此外，这两个核心信号轴之间复杂的串扰，介导IER3的促肿瘤和免疫抑制功能，已有充分记载，表明存在双向正调节，协同促进CRC进展。关键的是，IER3在癌症中的作用是高度环境依赖性的，这种双重性强调了其在CRC中促肿瘤功能的独特性。在某些恶性肿瘤中，如某些形式的宫颈癌和胃癌，据报道IER3通过促进凋亡和负调节致癌通路而充当肿瘤抑制因子。这种功能二分法对组织特异性、细胞环境和TME的动态高度敏感。例如，在具有强死亡受体信号的细胞环境中，IER3可以短暂增强凋亡，而在富含生存信号的环境中，如慢性TNF-α暴露——CRC的一个标志——它可以转换为促进NF-κB介导的生存和炎症。我们的研究结果表明，在以炎症通路组成性激活为特征的CRC特定景观中，IER3被协同作用为一个有效的致癌驱动因子。IER3表达与过度活跃的TNF-α/NF-κB通路及其下游FN1-CD44轴的收敛创建了一个前馈循环，有力地促进恶性进展和免疫逃逸，从而明确定义了其在该癌症类型中的促肿瘤作用。在临床转化方面，IER3表达逐渐增加并与不良临床和病理特征相关。其与血清CEA水平升高的关联进一步支持了其作为诊断和治疗生物标志物的潜力。此外，IER3在预测对ICB的反应和指导靶向治疗选择方面显示出强大的效用。这些发现突出了IER3作为CRC预后、治疗分层和 therapy 反应预测的有前途的生物标志物，从而促进个性化治疗和精准肿瘤学。IER3在关键信号通路交叉点的关键作用以及PDTC介导的IER3诱导的FN1分泌的逆转进一步强调了其作为CRC治疗靶点的潜力。这项研究通过TNF-α/NF-κB通路–FN1–CD44轴将IER3带到肿瘤免疫治疗的前沿，这不仅在驱动肿瘤进展方面具有临床意义，而且为克服免疫治疗耐药提供了潜在的联合靶点。FN1和CD44之间的相互作用可能直接参与塑造免疫抑制微环境，从而损害免疫检查点抑制剂的疗效。因此，靶向该信号轴联合抗PD-1/PD-L1 therapy 有望通过“解除免疫抑制”和“激活效应分子攻击”的双重机制产生协同抗肿瘤效果，这为CRC的联合免疫治疗提供了新策略。我们的研究有几个局限性。首先也是最关键的是，我们关于IER3调节免疫微环境和药物敏感性的核心结论主要来自生物信息学分析和算法预测，但这些发现本质上仍然是计算推断。最终，这些重要的生物学假设需要通过直接的功能实验来证实，例如操作细胞系中IER3的表达以观察其对T细胞功能的影响，或在动物模型中评估IER3在免疫治疗和化疗药物反应中的调节作用。其次，本研究中scRNA-seq的样本量相对有限，这可能限制了对稀有细胞亚群的识别和亚群异质性的全面表征。此外，尽管临床组织样本验证队列具有代表性，但其规模可以扩大。基于此，未来的工作应在更大、种族多样化的队列中进行验证，以评估其普遍性和临床适用性。此外，我们在机制层面的探索仍需深化。IER3与FN1-CD44轴之间的相互作用需要进一步的机制阐明和空间共定位验证。同时，TNF-α/NF-κB信号通路与FN1-CD44通路之间的潜在关联也迫切需要通过实验手段建立确凿的因果关系。尽管存在上述局限性，本研究通过系统的多组学分析为理解IER3在CRC中的复杂功能提供了新的视角和坚实的理论框架。基于目前的发现，未来的研究应侧重于（1）在体外和体内验证IER3的免疫调节和化学敏感性功能，（2）揭示IER3下游FN1-CD44轴的分子机制，以及（3）在临床前动物模型中严格评估靶向NF-κB通路（例如使用PDTC等抑制剂）的治疗潜力，以期最终将我们的发现转化为有效的临床治疗策略。
5. Conclusions
我们综合的单细胞转录组、功能和临床分析确定IER3是通过激活TNF-α/NF-κB信号通路和通过FN1-CD44轴重塑TIME来驱动CRC进展的关键驱动因子。高IER3表达识别出一个与侵袭性疾病、不良预后和对ICB反应减弱相关的恶性亚群。这些发现强调了IER3作为风险分层和治疗反应预测的生物标志物以及CRC精准肿瘤学策略的潜在靶点的临床相关性。
Ethics Statement
该研究根据《赫尔辛基宣言》进行，并获得了山西医科大学第一医院伦理委员会的批准。
Consent
从所有参与研究的受试者处获得了知情同意。已从患者处获得书面知情同意书以发布本文（如适用）。
Conflicts of Interest
作者声明无利益冲突。
Author Contributions
Zg.W.：撰写初稿、数据整理、形式分析、验证；Y.L.：撰写初稿、验证、可视化；Yp.Z.：撰写初稿、验证；Q.H.：撰写初稿、资源；J.S.：撰写初稿、验证；Yy.Z.：撰写初稿、验证；Yq.Z.：撰写初稿、可视化；Zm.W.：撰写初稿、资源；C.L.：撰写初稿、形式分析；Z.L.：撰写审阅编辑、数据整理、监督；Y.C.：撰写审阅编辑、概念化、项目管理、监督。
Funding
本研究得到国家临床重点专科建设和山西省重点医学学科发展的支持。
Acknowledgments
这项工作得到了国家临床重点专科发展和山西省重点医学学科建设的支持。我们感谢NovelBio Biotechnologies的曹原博士团队在单细胞测序数据分析方面的帮助。我们感谢患者捐赠组织样本。
Supporting Information
额外的支持信息可以在线的支持信息部分找到。
Data Availability Statement
本研究的原始数据可在TCGA和GEO中公开获取，
https://cancergenome.nih.gov/和
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；有关GEPIA的更多信息，请访问
https://gepia2.cancer-pku.cn/。单细胞转录组数据部分来源于GEO数据集GSE221575、GSE200997、GSE231559和GSE161277。支持本研究结果的所有其他数据可在本文的支持信息中找到。
