整合素α3β1-CSTF3信号轴调控Mmp9 mRNA的替代多聚腺苷酸化过程

《Matrix Biology》：An integrin α3β1-CSTF3 signaling axis regulates alternative polyadenylation of Mmp9 mRNA

α3β1整合素通过MEK/ERK信号通路调控皮肤重塑中Mmp9基因的近端剪接位点选择，促进稳定mRNA生成，并涉及CSTF3因子介导的替代polyadenylation调控，揭示其作为伤口和癌症治疗新靶点的潜力。

　　

Giesse Albeche Duarte | Ramon Bossardi Ramos | Lei Wu | Whitney M. Longmate | C. Michael DiPersio

美国纽约州奥尔巴尼市奥尔巴尼医学院外科系，邮编12208

摘要

层粘连蛋白结合整合素α3β1在表皮角质形成细胞中高表达，在皮肤重塑过程中协调多种细胞功能和基因表达。本文研究表明，α3β1-MEK/ERK信号通路在体内作用下促进Mmp9基因近端多聚腺苷化位点（PAS）的使用，从而生成更短、更稳定的mRNA转录本。利用可诱导表达表皮特异性α3β1缺失的小鼠，通过RNA原位杂交技术发现，α3β1的缺失会增加愈合伤口和表皮肿瘤中Mmp9基因的长转录本长度。α3β1-MEK/ERK信号通路在角质形成细胞中诱导切割刺激因子CSTF3的表达，而CSTF3是一种已知的可变多聚腺苷化（APA）调节因子；CSTF3的敲低则使Mmp9基因倾向于使用远端PAS。此外，α3β1的缺失还降低了Cstf3基因的表达，并改变了体内的APA过程。全基因组DaPars2分析发现，α3β1调控多个基因的可变多聚腺苷化现象，其中包括一些编码角质形成细胞分泌组的成分。这些发现共同揭示了一个新的α3β1-MEK/ERK-CSTF3轴，该轴通过APA机制调控转录后基因表达，表明α3β1可能是治疗伤口和癌症的潜在靶点。

引言

整合素是细胞与细胞外基质（ECM）结合的主要受体，因此它们调节组织重塑过程中细胞对外部微环境变化的多种反应[[1], [2], [3]]。在表皮中，整合素α3β1是皮肤基底膜中层粘连蛋白-332的受体，在皮肤发育和重塑过程中促进多种角质形成细胞功能[4]。α3β1在正常伤口愈合中起重要作用，其失调可能导致病理性伤口愈合以及多种类型癌症（包括鳞状细胞癌和乳腺癌）的发生[[4], [5], [6], [7]]。α3β1的临床重要性还体现在间质性肺病、肾病综合征和表皮松解症（ILNEB）患者中，后者是一种由ITGA3基因突变引起的严重遗传性疾病，患者通常在出生后几个月内死亡[[8], [9], [10], [11], [12], [13]]。

我们之前的临床前模型研究表明，α3β1调控了角质形成细胞转录组的很大一部分，包括在正常或病理组织重塑过程中控制自主和旁分泌细胞功能的基因[14]。许多依赖α3β1的基因编码角质形成细胞分泌组的蛋白质，如介导与其他细胞旁分泌相互作用的生长因子或细胞因子[[15], [16], [17]]，以及参与ECM重塑的基质蛋白或细胞外蛋白酶[[18], [19], [20], [21]]。后者包括基质金属蛋白酶-9（MMP-9），我们已将其与伤口和皮肤肿瘤中依赖α3β1的角质形成细胞功能联系起来[20,22,23]。α3β1的信号传导可以通过转录调控或转录后mRNA加工来调节基因表达，后者通过影响mRNA稳定性实现[[5]]。例如，α3β1依赖的可变剪接可控制Cox-2 mRNA的无义介导的mRNA降解（NMD）[24]，或者α3β1依赖的可变多聚腺苷化（APA）可决定Mmp9 mRNA 3′非翻译区（3′UTR）中富含AU元件（AREs）的包含情况，从而在体外使其受到ARE介导的降解[25]。

APA是一种广泛存在的转录后机制，影响大多数人类基因，并且在哺乳动物物种间具有保守性[26]。通过生成具有不同3′UTR的mRNA异构体，APA调节mRNA与microRNAs和RNA结合蛋白的相互作用，进而影响其翻译、定位和/或稳定性[[27], [28], [29]]。APA引起的mRNA稳定性变化通常是由于包含或排除调控性3′UTR元件（如AREs或NMD触发序列）[30,31]。APA模式也会随着生理变化或细胞状态的不同而改变。例如，增殖细胞通常产生较短的3′UTR，从而增强与细胞生长相关的mRNA稳定性；而衰老细胞则产生较长的3′UTR，促进mRNA降解[32]。

APA的失调越来越多地与癌症和其他组织病理相关[[27], [28], [29], [33,34]]。事实上，许多基因在肿瘤中的mRNA异构体比在正常组织中更短，这为逃避mRNA降解和维持促进肿瘤生长和进展的基因的高表达提供了机制[32]。多项研究表明，某些多聚腺苷化因子的表达改变可以驱动具有组织病理或疾病进展重要功能的基因的APA[35], [36], [37], [38]]。新兴疗法旨在通过靶向APA的核心机制来调节APA，尽管这一调控过程的复杂性以及可能对转录组产生的广泛脱靶效应仍是一个挑战[33,34,39]。此外，目前尚不清楚组织微环境中的细胞外信号如何影响调节APA的细胞内信号通路。因此，需要鉴定APA的上游调控因子，这些因子可能成为新的治疗靶点。

我们之前在永生化角质形成细胞中的研究表明，整合素α3β1通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MEK/ERK）信号通路，促进Mmp9基因中上游（即近端）PAS的使用，从而生成由于3′UTR中去除多个不稳定AREs而稳定性增强的短mRNA变体[25]。重要的是，α3β1的缺失会导致使用下游（即远端）PAS，生成包含这些AREs的较长mRNA转录本，因此稳定性较低[25]。然而，α3β1-MEK/ERK信号通路促进pPAS使用的具体机制，以及α3β1依赖的Mmp9 mRNA APA是否在体内发生或扩展到其他目标基因，目前尚不清楚。

在本研究中，我们使用他莫昔芬诱导的表皮特异性α3缺失小鼠，证明了α3β1在体内皮肤重塑过程中调节Mmp9 mRNA的APA。此外，我们还发现α3β1-MEK/ERK信号通路诱导切割刺激因子亚基3（CSTF3）的表达，CSTF3是一种与其它基因的APA相关的多聚腺苷化因子[36,37]。我们还发现，通过RNA干扰（RNAi）抑制角质形成细胞中的Cstf3基因可以促进Mmp9基因中使用远端PAS，生成长mRNA变体。此外，在体内皮肤肿瘤中删除α3会导致Cstf3表达降低，同时Mmp9 mRNA长度增加，Mmp9 mRNA水平下降。最后，对表达α3和α3缺失的角质形成细胞系进行DaPars2分析表明，α3β1依赖的APA扩展到多个受α3β1调控的基因。因此，我们的研究确定了这个α3β1-MEK/ERK-CSTF3轴作为APA的关键调控因子，揭示了一种新的整合素依赖的转录后基因调控机制，有助于塑造角质形成细胞的转录组。

技术细节

开发RNA ISH方法评估Mmp9 mRNA的整合素α3β1依赖性APA

我们之前使用RNase保护技术证明了α3β1在永生化小鼠角质形成细胞（MK）系中调节Mmp9 mRNA的APA[25]。在本研究中，我们试图确定这种调控是否在体内皮肤重塑过程中发生。然而，RNase保护技术难以直接应用于体内模型，因为它无法提供组织环境下的空间分辨率。为了解决这一限制，我们开发了用于RNAcope原位杂交（RNA ISH）的探针组

讨论

近年来，APA已成为多种正常和病理组织重塑过程中的主要基因调控方式[29,32,33,53]。例如，免疫细胞常利用APA来调节快速响应基因[58]，而特定多聚腺苷化因子的表达或功能改变导致的APA失调与多种疾病的病理有关，如急性髓系白血病[35]、真皮纤维化[38]和癌症[36,37]。然而，其具体机制仍不清楚

小鼠模型

体内研究使用了K14CreERT:Itga3flx/flx小鼠，该小鼠具有混合品系背景。如其他文献所述[14]，使用4OHT对皮肤进行局部处理可诱导表皮特异性Itga3基因的缺失，并消除处理区域的整合素α3β1。该模型结合了皮肤伤口愈合或两步皮肤肿瘤发生检测

资助

本研究得到了美国国立卫生研究院对C. M. DiPersio（来自国家癌症研究所，项目编号R01CA129637）以及C. M. DiPersio和J. M. Lamar（来自国家关节炎和肌肉骨骼皮肤疾病研究所，项目编号R01AR063778）的资助。

作者贡献

概念构思：GAD, CMD；数据管理：GAD, RBR；形式分析：GAD, RBR；资金获取：CMD；研究实施：GAD, LW, WML；项目管理：CMD；资源提供：WML, CMD；监督：GAD, CMD；验证：GAD, RBR；可视化：GAD, CMD；初稿撰写：GAD；审稿和编辑：GAD, RBR, WML, CMD。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢DiPersio实验室的所有成员在整个研究过程中提供的有益讨论和技术支持。特别感谢Emily Norton在RNAi实验方面的宝贵建议，以及John Lamar博士、Alex Adam博士和Jacob Snyder博士对手稿提出的建设性意见。