一种利用分子印迹多巴胺聚合物对布鲁氏菌（Brucella abortus）进行新型阻抗检测的方法

《Microchemical Journal》：A novel impedimetric detection of Brucella abortus bacteria using molecularly imprinted polydopamine polymer

基于聚多巴胺分子印迹聚合物和电化学阻抗谱（EIS）开发了高灵敏（10-10^6 CFU/mL，R2=0.9925）且选择性强的布鲁氏菌传感器，优于传统方法如细菌培养、PCR和ELISA。

　　

Saad S.M. Hassan|Aya A. Abdelrahman|Hossam E.M. Sayour|Ashraf E. Sayour|Teraze A. Youssef|Mahmoud Abdelwahab Fathy

埃及开罗艾因沙姆斯大学理学院化学系，Abassia，邮编11566

摘要

本文开发了一种高选择性和高灵敏度的电化学生物传感器，用于检测布鲁氏菌（Brucella abortus）。该传感器利用通过电聚合多巴胺在丝网印刷金电极上合成的分子印迹聚合物（MIP）来实现检测功能。制备过程简单、成本低廉，且适合大规模生产。通过拉曼光谱、场发射扫描电子显微镜（FESEM）和原子力显微镜（AFM）对传感器进行了形态和结构表征，证实了印迹成功且薄膜形成均匀。电化学阻抗谱（EIS）检测结果显示，该传感器在10至10⁶ CFU/mL的范围内具有高灵敏度，相关系数（R²）为0.9925，最大ΔR_ct为37.56 kΩ。针对与布鲁氏菌密切相关的非目标细菌物种（包括布鲁氏菌梅利滕西斯亚种（Brucella melitensis）、布鲁氏菌猪亚种（Brucella suis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）的检测表明，该传感器几乎没有交叉反应，证明了其对布鲁氏菌的高度识别能力。与其他电活性单体（如聚苯胺、聚（吡咯丙酸）、聚（吡咯-2-羧酸）和聚（2-氨基酚））为基础的传感器相比，基于多巴胺的传感器响应明显较低，这可能是由于后者的导电性较低、兼容性较差以及薄膜性能不佳所致。与基于细菌培养、PCR和ELISA的方法相比，所开发的技术具有许多优势，后者通常成本较高、耗时较长且需要专用设施。该传感器具有高选择性、快速响应、高稳定性、长使用寿命、优异的鲁棒性和通用性以及灵活的设计。这些结果突显了基于多巴胺的MIP/阻抗谱传感器在实际布鲁氏菌检测中的潜力，并为其未来集成到便携式诊断设备中以实现连续样品分析提供了支持。

引言

尽管医学技术、制药业和疫苗取得了显著进展，传染病仍然对全球构成重大挑战[1]。其中，由布鲁氏菌属细菌引起的布鲁氏菌病是全球最普遍的人畜共患病之一，尤其是在依赖畜牧业的地区，如地中海盆地、中东、非洲和南亚[2]。布鲁氏菌病对人类健康和农业经济都具有重要影响，因此迫切需要快速、准确且经济高效的诊断方法来控制其传播和影响[3],[4],[5]。

布鲁氏菌属细菌是革兰氏阴性、胞内球杆菌，缺乏荚膜、鞭毛和内孢子等传统毒力因子，但它们具备在恶劣条件下生存的独特机制[6]。这些细菌可以在土壤、灰尘、水以及受污染的食品（如肉类和乳制品）中存活，也可以存在于受感染动物的生殖组织中，包括流产胎儿和胎盘。最常见的致病菌种布鲁氏菌流产亚种（Brucella abortus）、布鲁氏菌梅利滕西斯亚种（Brucella melitensis）和布鲁氏菌猪亚种（Brucella suis）可感染多种哺乳动物，人类则是其偶然宿主[7]。

布鲁氏菌病在牲畜中可导致不育、流产和牛奶产量显著下降，给动物主人造成重大经济损失。此外，受感染的乳动物可通过牛奶排出布鲁氏菌，从而对公共卫生构成威胁。在巴氏杀菌措施不完善的地区，饮用未经巴氏杀菌的乳制品（如牛奶、奶酪和酸奶）是布鲁氏菌病在人类中传播的主要途径[8]。在人类中，布鲁氏菌病表现为一种衰弱性疾病，其特征是长期发热、关节和肌肉疼痛以及严重情况下的慢性并发症，如关节炎、脊椎炎和心内膜炎[9]。这种人畜共患病的慢性特征及其传播能力凸显了有效监测和诊断技术的必要性。

已经开发出多种诊断方法来检测动物和人类中的布鲁氏菌，但每种方法都有其局限性。细菌培养被认为是诊断布鲁氏菌病的金标准，需要从血液或组织等临床样本中分离布鲁氏菌[10],[11],[12]。虽然培养方法具有高度特异性，但耗时较长且需要复杂的实验室设施（包括生物安全等级3级（BSL-3）的实验室），因为存在较高的实验室感染风险。此外，当处理慢性病例时，细菌培养的灵敏度往往较低[13]。基于聚合酶链反应（PCR）的方法已成为检测临床样本中布鲁氏菌 DNA的替代方法[14]。尽管PCR能快速出结果且具有高特异性，但其灵敏度受细菌在细胞内的位置以及低细菌载量或基质抑制物的影响而受限。血清学检测因其简单性和易用性而被广泛使用，但它们常与其他细菌发生交叉反应，无法区分当前感染和既往感染[15]。这些局限性共同表明，需要开发适用于分散式检测的快速、高选择性的诊断平台。

近年来，生物传感器技术在克服传统诊断方法的局限性方面显示出巨大潜力，特别是通过开发微型化和低成本电化学设备[16],[17],[18]。其中一种有前景的方法是使用分子印迹聚合物（MIP），通常被称为塑料抗体[19]。MIP是一种合成聚合物，旨在模仿天然抗体的分子识别特性，具有高稳定性、低成本和易于生产等优点[20],[21],[22]。与生物受体相比，基于MIP的策略越来越多地用于全细胞细菌检测，其中完整细胞的印迹生成与其大小、形状和表面化学性质相匹配的识别位点，即使在恶劣条件下也能实现强健和选择性的细菌识别[23],[24]。

将分子印迹聚合物（MIP）整合到电化学生物传感器中，尤其是基于电化学阻抗谱（EIS）的传感器中，为布鲁氏菌的检测提供了一种强大的新策略。EIS能够无需标记或额外试剂即可灵敏地监测细菌结合事件引起的界面阻抗变化[25],[26]。

在用于MIP制备的各种功能单体中，多巴胺（PDA）在微制造和纳米工程领域引起了越来越多的关注。它因对电极表面的强粘附性、出色的成膜能力和来自 catechol 和胺基团的丰富化学性质而在增强微芯片和纳米结构设备的功能性方面表现出显著作用[27],[28],[29],[30]。这些功能基团能够与细菌表面成分（如脂多糖和外膜蛋白）发生多种非共价相互作用（如氢键、静电吸引和π–π相互作用），从而实现有效的全细胞印迹和选择性重新结合。然而，利用基于多巴胺的MIP通过全细胞印迹进行布鲁氏菌流产亚种的选择性阻抗检测的研究仍较少。

与此同时，文献中报道了几种用于布鲁氏菌

Saad S.M. Hassan|Aya A. Abdelrahman|Hossam E.M. Sayour|Ashraf E. Sayour|Teraze A. Youssef|Mahmoud Abdelwahab Fathy

埃及开罗艾因沙姆斯大学理学院化学系，Abassia，邮编11566

摘要

本文开发了一种高选择性和高灵敏度的电化学生物传感器，用于检测布鲁氏菌流产亚种（Brucella abortus）。该传感器利用通过电聚合多巴胺在丝网印刷金电极上合成的分子印迹聚合物（MIP）来实现检测功能。制备过程简单、成本低廉，且适合大规模生产。通过拉曼光谱、场发射扫描电子显微镜（FESEM）和原子力显微镜（AFM）对传感器进行了形态和结构表征，证实了印迹成功且薄膜形成均匀。电化学阻抗谱（EIS）检测结果显示，该传感器在10至10⁶ CFU/mL的范围内具有高灵敏度，相关系数（R²）为0.9925，最大ΔR_ct为37.56 kΩ。针对与布鲁氏菌密切相关的非目标细菌物种（包括布鲁氏菌梅利滕西斯亚种（Brucella melitensis）、布鲁氏菌猪亚种（Brucella suis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）的检测表明，该传感器几乎没有交叉反应，证明了其对布鲁氏菌流产亚种的高度识别能力。与其他电活性单体（如聚苯胺、聚（吡咯丙酸）、聚（吡咯-2-羧酸）和聚（2-氨基酚））为基础的传感器相比，基于多巴胺的传感器响应显著较低，这可能是由于后者的导电性较低、兼容性较差以及薄膜性能不佳。与基于细菌培养、PCR和ELISA的方法相比，所开发的技术具有许多优势，后者通常成本较高、耗时较长且需要专用设施。该传感器具有高选择性、快速响应、高稳定性、长使用寿命、优异的鲁棒性和通用性以及灵活的设计。这些结果突显了基于多巴胺的MIP/阻抗谱传感器在实际布鲁氏菌流产亚种检测中的潜力，并为其未来集成到便携式诊断设备中以实现连续样品分析提供了支持。

引言

尽管医学技术、制药业和疫苗取得了显著进展，传染病仍对全球构成重大挑战[1]。其中，由布鲁氏菌属细菌引起的布鲁氏菌病是全球最普遍的人畜共患病之一，尤其是在依赖畜牧业的地区，如地中海盆地、中东、非洲和南亚[2]。布鲁氏菌病对人类健康和农业经济都有严重影响，因此迫切需要快速、准确且经济高效的诊断方法来控制其传播和影响[3],[4],[5]。

布鲁氏菌属细菌是革兰氏阴性、胞内球杆菌，缺乏荚膜、鞭毛和内孢子等传统毒力因子，但它们具备在恶劣条件下生存的独特机制[6]。这些细菌可以在土壤、灰尘、水以及受污染的食品（如肉类和乳制品）和受感染动物的生殖组织（包括流产胎儿和胎盘）中存活。最常见的致病菌种布鲁氏菌流产亚种（Brucella abortus）、布鲁氏菌梅利滕西斯亚种（Brucella melitensis和布鲁氏菌猪亚种（Brucella suis）可感染多种哺乳动物，人类是其偶然宿主[7]。

布鲁氏菌病在牲畜中可导致不育、流产和牛奶产量显著下降，给动物主人造成重大经济损失。此外，受感染的乳动物可通过牛奶排出布鲁氏菌，对公共卫生构成威胁。在巴氏杀菌措施不完善的地区，饮用未经巴氏杀菌的乳制品（如牛奶、奶酪和酸奶）是布鲁氏菌病在人类中传播的主要途径[8]。在人类中，布鲁氏菌病表现为一种衰弱性疾病，其特征是长期发热、关节和肌肉疼痛，严重情况下会出现慢性并发症，如关节炎、脊椎炎和心内膜炎[9]。这种人畜共患病的慢性特征及其传播能力凸显了有效监测和诊断技术的必要性。

已经开发出多种诊断方法来检测动物和人类中的布鲁氏菌，但每种方法都有其局限性。细菌培养被认为是诊断布鲁氏菌病的金标准，需要从血液或组织等临床样本中分离布鲁氏菌[10],[11],[12]。虽然培养方法具有高度特异性，但耗时较长且需要复杂的实验室设施（包括生物安全等级3级（BSL-3）的实验室），因为存在较高的实验室感染风险。此外，细菌培养的灵敏度通常较低，尤其是在处理慢性病例时[13]。基于聚合酶链反应（PCR）的方法已成为检测临床样本中布鲁氏菌 DNA的替代方法[14]。尽管PCR能快速出结果且具有高特异性，但其灵敏度受细菌在细胞内的位置以及低细菌载量或基质抑制剂的影响而受限。血清学检测因其简单性和易用性而被广泛使用；然而，它们常与其他细菌发生交叉反应，无法区分当前感染和既往感染[15]。这些局限性共同表明，需要开发适用于分散式检测的快速、高选择性的诊断平台。

近年来，生物传感器技术在克服传统诊断方法的局限性方面显示出巨大潜力，特别是通过开发微型化和低成本电化学设备[16],[17],[18]。其中一种有前景的方法是使用分子印迹聚合物（MIP），通常被称为塑料抗体[19]。MIP是一种合成聚合物，旨在模仿天然抗体的分子识别特性，具有高稳定性、低成本和易于生产等优点[20],[21],[22]。与生物受体相比，基于MIP的策略越来越多地用于全细胞细菌检测，其中完整细胞的印迹生成与其大小、形状和表面化学性质相匹配的识别位点，即使在恶劣条件下也能实现强健和选择性的细菌识别[23],[24]。

将分子印迹聚合物（MIP）整合到电化学生物传感器中，尤其是基于电化学阻抗谱（EIS）的传感器中，为布鲁氏菌的检测提供了一种强大的新策略。EIS能够无需标记或额外试剂即可灵敏地监测细菌结合事件引起的界面阻抗变化[25],[26]。

在用于MIP制备的各种功能单体中，多巴胺（PDA）在微制造和纳米工程领域引起了越来越多的关注。它因对电极表面的强粘附性、出色的成膜能力和来自catechol和胺基团的丰富化学性质而在增强微芯片和纳米结构设备的功能性方面表现出显著作用[27],[28],[29],[30]。这些功能基团能够与细菌表面成分（如脂多糖和外膜蛋白）发生多种非共价相互作用（如氢键、静电吸引和π–π相互作用），从而实现有效的全细胞印迹和选择性重新结合。然而，利用基于多巴胺的MIP通过全细胞印迹进行布鲁氏菌流产亚种的选择性阻抗检测的研究仍较少。

与此同时，文献中报道了几种用于布鲁氏菌检测的电化学传感策略。基于DNA的基因传感器依赖于探针杂交和纳米材料辅助的信号放大，包括基于钯纳米颗粒和金纳米带纳米结构的电化学基因传感器，用于超灵敏地检测布鲁氏菌 DNA[31],[32]。此外，还开发了使用抗体作为生物识别元素的免疫传感器平台，通过电化学阻抗谱或表面等离子体共振转导方案进行布鲁氏菌检测[33],[34]。最近，还报道了结合金纳米颗粒辅助的比色读出策略的适配体传感器，用于快速和简单地检测布鲁氏菌细胞[35]。虽然这些方法表现出有前景的分析性能，但它们的识别和信号转导原理与本文描述的全细胞分子印迹策略不同。

本研究描述了一种利用分子印迹聚合物检测布鲁氏菌的新电化学生物传感器。通过将全细菌细胞印迹的多巴胺薄膜整合到丝网印刷金电极上，并使用电化学阻抗谱作为转导方法，开发了一种便携且成本效益高的传感平台，用于选择性检测布鲁氏菌流产亚种。实验工作包括：（1）研究影响使用多巴胺聚合物印迹布鲁氏菌流产亚种细菌全细胞的所有参数；（2）制备用于阻抗读出设备的敏感和选择性识别膜；（3）优化测量条件，以便在未来阶段适用于不同类型和来源的实际样品的临床和农业应用。

设备

电化学测量（包括电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）使用Metrohm电位计/电流计（Autolab型号204，Metrohm Autolab B.V.，荷兰乌得勒支）进行，软件版本为NOVA 2.1。用于传感器制备的金丝网印刷电极（Au-SPEs）来自PalmSens（荷兰），配置有金工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极。

拉曼光谱分析

拉曼光谱用于比较合成的分子印迹聚合物（MIP）与非印迹聚合物（NIP）的结构特征。如图S2所示，两种光谱都显示了两个主要峰，分别对应于多巴胺基薄膜的特征D带（1370 cm^?1?1）。

结论

开发了一种基于分子印