现场可应用的柑橘类植物由链格孢菌（Alternaria）引起的病害诊断方法：利用CRISPR/Cas12a技术扩增的PGM（Phytochrome-Gated Membrane）信号蛋白进行检测

《Microchemical Journal》：Field-deployable Citrus Alternaria diagnosis using CRISPR/Cas12a-amplified PGM signaling

柑橘黑斑病菌检测方法开发：基于CRISPR/Cas12a、TSA信号放大与便携式血糖仪的快速诊断系统，灵敏度达50 pM，特异性验证及实际样本检测均显示良好性能。

　　

马兰瑞|杨璐|董继尧|谢龙英子|吴琦|崔永亮|张耀海|郑浩|王成秋|何月

农业农村部柑橘果实质量安全控制重点实验室，西南大学，国家柑橘工程技术研究中心，柑橘研究所，重庆400712，中国

摘要

由链格孢引起的柑橘褐斑病的传播是对柑橘产业最具破坏性的威胁之一。本文提出了一种基于CRISPR/Cas12a的链格孢检测平台。结合磁分离技术，通过HRP介导的酪胺信号放大技术和链霉亲和素与生物素的有效结合技术，成功将大量生物素化转化酶锚定在金纳米颗粒上。最后，使用个人血糖仪读取检测信号。该方法可以检测到浓度低至50 pM的合成目标双链DNA，并显示出令人满意的特异性。通过对链格孢细胞和田间样本的分析，证实了该方法的实用性。值得注意的是，使用我们的方法获得的结果与qPCR的结果一致。这种创新方法方便、成本低廉，且提供与qPCR检测结果一致的结果，从而有助于现场诊断链格孢。

引言

柑橘是最重要的水果作物之一，在137多个国家进行商业化种植。[1]然而，柑橘在生长发育过程中总是受到生物胁迫的影响，尤其是病原体的影响。[2]链格孢是一种常见的植物病原体，会导致柑橘褐斑病，造成巨大的经济损失，并严重阻碍柑橘产业的发展。[3],[4]此外，链格孢的代谢产生的霉菌毒素可能存在于柑橘果实中，食用这些食物可能导致严重的健康问题，包括畸形、癌症、突变等。[5]随着柑橘生产和消费的不断扩大，链格孢对人类健康的威胁日益增加，可能带来严重的后果。因此，有必要在链格孢感染的早期阶段准确检测其存在。这有助于实现有效的植物病害管理，减轻经济损失并确保食品安全。

目前用于识别链格孢的方法主要包括传统的形态分析和核酸分析。[6]尽管基于培养的检测方法可以提供可靠的结果，但由于在感染早期可用的细菌菌株非常少，这些方法耗时且劳动强度高。[7]最近，以非等温扩增技术[8]和等温扩增技术[2],[9]为代表的核酸扩增技术在链格孢的检测中表现出优异的诊断性能。然而，基于核酸扩增的技术需要昂贵的设备、专业操作和熟练工人，不适合资源有限的地区。[10]因此，在工业发展和食品安全监督中，需要价格合理、便携且具有特异性的新方法来进行链格孢的即时检测（POCT）。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白系统是细菌的获得性免疫系统。[11],[12],[13]由于CRISPR/Cas系统能够精确识别目标核酸序列，基于该系统的新型生物传感器在近年来显示出优异的核酸检测性能。[14],[15]Cas12a是Cas蛋白家族的成员，作为一种RNA引导的内切酶，具有对非特异性单链DNA（ssDNA）的转切活性。[16],[17],[18]基于这一特性，Cas12a促进了核酸检测多个领域的即时检测技术的发展，包括病毒[19]、转基因作物[20]和病原菌[21]。结合核酸预扩增技术[1],[22]，这种激活模式使Cas12a/crRNA介导的ssDNA切割能够实现荧光检测。然而，荧光检测方法需要昂贵的仪器和受过培训的操作人员。[23]在某些情况下，基于Cas12a的即时检测技术的成功商业化需要考虑便携式设备用于信号记录。[24],[25]

个人血糖仪（PGM）具有低成本、体积小、易于使用和高可靠性等优点。[26],[27],[28]近年来，研究人员开发了多种传感器来克服PGM在非葡萄糖检测方面的局限性。[29]转化酶介导的蔗糖到葡萄糖的转化使PGM能够检测多种分析物，包括核酸[30]、蛋白质[31]、毒素[32]、酶[31]等。周等人[33]提出了一种基于CRISPR/Cas12a和PGM的沙门氏菌检测方法，检测限为5个菌落形成单位。方等人[34]提出了一种改进的CRISPR-PGM方法，用于检测SARS-CoV-2 N基因或hDNA，分别达到了50个拷贝/μL和11.0 fM的检测限。因此，PGM和CRISPR/Cas12a系统的结合有望构建一个用户友好且特定的现场可部署的诊断系统。此外，为了提高检测灵敏度，我们打算引入经典的酪胺信号放大（TSA）[35],[36]策略。TSA策略利用辣根过氧化物酶（HRP）催化的酪胺偶联物在目标蛋白附近沉积，从而放大检测信号。[35]作为一种有效的方法，TSA策略在细菌[37]、病毒[38]、细胞[39]等领域的诊断中受到了越来越多的关注。

最近，金纳米颗粒（AuNPs）由于其生物相容性和较大的表面积，成为共载酶和ssDNA的理想纳米载体。[40]胡等人[41]报道了一种基于冷冻的方法，可以使ssDNA和HRP同时附着在AuNPs表面。通过将HRP锚定在AuNPs表面，我们旨在整合AuNPs的信号放大特性和TSA。这种方法有望促进AuNPs上的多次TSA反应，从而提高检测灵敏度。

鉴于上述情况，建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统、TSA策略和PGM读数的链格孢检测方法。核酸的浓度调节CRISPR/Cas12a系统的转切活性，从而使得检测溶液中PGM信号的变化与链格孢基因的浓度之间存在强相关性。该方法的特异性和灵敏度源于CRISPR/Cas12a的识别能力和TSA的信号放大的有效结合。此外，通过对培养的链格孢、其他与柑橘病相关的微生物以及柑橘植物田间样本的分析，验证了该方法的实用性。该方法的良好性能表明它在快速现场检测链格孢污染方面具有巨大潜力。此外，它为在资源有限的地区扩展基于Cas12a的POCT的应用以及使用PGM分析非葡萄糖目标提供了有前景的方法。

合成双链DNA激活剂分析

首先，混合7.5 μL无DNase/RNase的水、2 μL Holmes缓冲液（10 ×）、2 μL合成双链DNA（10 nM）（无模板对照使用无DNase/RNase的水）、4.5 μL底物单链DNA（50 nM）、2 μL LbCas12a（500 nM）和2 μL crRNA（1 μM），然后在45°C下孵育40分钟。接下来，将15 μL捕获探针和15 μL耦合缓冲液混合，在25°C下孵育10分钟。之后，用耦合缓冲液清洗三次。

提出的CRISPR/Cas12a-TSA-PGM方法原理

提出的CRISPR/Cas12a-TSA-PGM方法的原理如图1所示。具体来说，长度为27个碱基的单链DNA作为CRISPR/Cas12a 转切反应的底物（表S1）。首先，部分与底物单链DNA互补的捕获单链DNA被固定在SA-MBs表面，形成捕获探针（图S1）。与底物单链DNA剩余部分互补的信号单链DNA与HRP一起被

结论

总之，我们成功开发了一种用于诊断链格孢感染的检测方法，该方法结合了CRISPR技术和TSA，并使用市售的PGM作为信号读出设备。PGM作为最广泛采用的便携式即时检测仪器之一，具有便携性、低成本、快速响应、用户友好操作和直观结果等固有优势，这些都有助于该方法的实用性。

CRediT作者贡献声明

马兰瑞：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、软件、方法学、调查、数据分析、概念化。 杨璐：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、软件、数据分析。 董继尧：撰写 – 审稿与编辑、软件。 谢龙英子：可视化、软件。 吴琦：软件、方法学。 崔永亮：资源支持。 张耀海：验证、方法学。 郑浩：资源支持、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢中国农业研究系统（编号：CARS-26）的财政支持。