《Microchemical Journal》：A colorimetric biosensor for
Salmonella detection combining cascaded Magnetophoretic separation and Nanozyme signal amplification
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快速灵敏检测沙门氏菌的集成磁性微流控 biosensor 开发
Jiaqing Duan|Yaxuan Liu|Jing Yuan|Yuntao Li|Zhiyong Li|Yuhe Wang|Jianhan Lin
国家数字农产品流通创新中心，农业农村部，中国农业大学，北京100083，中国
摘要
快速灵敏地检测食品中的沙门氏菌对于保障公共卫生和预防疾病爆发至关重要。使用免疫磁纳米珠（IMNBs）进行磁分离已被证明可以有效富集沙门氏菌，然而未结合的IMNBs与IMNB-沙门氏菌结合物的共存使得IMNBs无法作为下游细菌检测的信号标记。在这项工作中，我们提出了一种新的比色生物传感器，通过整合铂修饰的IMNBs（IMNBs@Pt）来实现目标细菌的特异性分离和标记，并利用微流控芯片将结合物与未结合的IMNBs@Pt进行级联磁泳分离，从而实现高效的细菌分离和有效的信号放大。在优化条件下，该生物传感器能够在1小时内定量检测1.4×102至1.4×106 CFU/mL的沙门氏菌，检测限为65 CFU/mL。该生物传感器操作简便、耗时短且灵敏度高，具有作为食品安全监测现场检测工具的潜力。
引言
食品安全对于保护公众健康至关重要，而食源性病原体的污染是微生物食品安全问题的主要原因之一[1]。其中，沙门氏菌是最普遍且影响最严重的食源性病原体之一，导致了多起疫情爆发，因此需要开发快速准确的检测方法[2],[3],[4]。传统的沙门氏菌检测方法，如基于培养的检测、酶联免疫吸附测定和聚合酶链反应，通常存在程序繁琐、操作复杂和设备要求高等局限性[5],[6],[7]。这些缺点凸显了迫切需要一种快速、简单且高效的检测策略（[8]；Gao等人，2024年）。
高效分离目标细菌是实现灵敏检测的前提。传统的免疫磁分离技术依靠抗原和抗体之间的特异性相互作用来选择性地捕获目标细菌，具有良好的特异性和高分离效率[9],[10]。然而，这些方法往往受到通量低和处理程序复杂的限制[11],[12]。近年来，出现了一系列新型磁分离技术，如高梯度磁分离[13],[14],[15]、磁泳分离[16],[17],[18]和磁栅格分离[19],[20],[21]，以应对这些挑战。虽然这些方法能够自动化处理大量样本并简化操作，但它们通常设计用于将目标细菌从背景基质中分离出来，无法有效区分磁性细菌和游离的MNBs[22],[23]。高效分离磁性细菌和游离MNBs的能力对于提高检测灵敏度至关重要。
信号放大是影响细菌检测灵敏度的另一个关键因素。纳米酶是一种具有酶模拟催化活性的纳米材料，由于其高催化效率、易于合成、稳定性和低成本而受到广泛关注[24]。其中，基于贵金属的纳米酶由于其独特的物理化学性质和优异的生物相容性而显示出巨大潜力[25],[26],[27],[28]。然而，大多数现有研究仅将贵金属纳米酶作为信号探针使用，需要额外的MNBs进行分离，这增加了工作流程的复杂性[29]。为了解决这个问题，我们提出将MNBs与Pt纳米酶功能化，使它们既能作为分离载体又能作为催化探针，从而简化检测过程并提升整体性能。
在我们之前的研究[30],[31]中，我们展示了一种能够将磁性细菌与游离MNBs分离的磁泳分离装置。然而，单阶段分离效果不足，且涉及流体通过分离通道的循环操作较为复杂。为了克服这些限制，我们开发了一种级联磁泳分离微流控芯片，能够有效去除游离的IMNBs@Pt并选择性收集磁性标记的细菌。如图1所示，首先将IMNBs@Pt与细菌样本混合形成磁性细菌混合物，然后将该混合物与高流速的PBS一起注入级联磁泳分离芯片中，每个分离单元都对应由两个排斥环形磁铁产生的高梯度磁场。两个磁泳分离阶段在相似的磁场配置下运行，但通过不同的流动条件和操作参数执行互补功能。在第一阶段，采用相对温和的条件去除非目标细菌和大部分游离的IMNBs@Pt，同时保持磁性细菌的高回收率。在第二阶段，调整流动条件以实现更严格的分离，有效去除剩余的游离IMNBs@Pt。这种级联设计将大量去除与精细纯化分离分开，从而在不影响磁性细菌收集效率的情况下实现游离IMNBs@Pt的有效清除。收集到的磁性细菌用于催化比色反应，将无色的TMB转化为蓝色的TMBox，从而实现对细菌浓度的定量分析。
材料与试剂
磁纳米珠（100 nm，10 mg/mL，柠檬酸修饰）购自中科黎明（北京，中国）。多克隆抗体购自Meridian（目录号：C86309M，辛辛那提，OH，美国）。氯铂酸（H2PtCl6）购自Sigma。硼氢化钠（NaBH4）购自Aladdin。磷酸盐缓冲液（PBS，10 mM，pH 7.4）和H2O2-TMB底物购自Solarbio（北京，中国）。牛血清白蛋白（BSA）购自EM Science。去离子水
磁泳分离原理
组装好的微流控芯片、磁铁和支持装置如图2a所示，突出了它们的相对位置和固定方法。图2b展示了由两个排斥配置的磁铁产生的磁通密度的COMSOL模拟结果，形成的场分布呈现同心的高梯度磁环。在模拟中，磁材料的性质、尺寸和相对排列与实际使用的相匹配
结论
在这项研究中，我们开发了一种集成微流控生物传感器，利用双功能IMNBs@Pt快速、灵敏且特异性地检测复杂食品样本中的沙门氏菌
CRediT作者贡献声明
Jiaqing Duan：撰写——原始草稿、方法学、数据管理、概念化。Yaxuan Liu：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、方法学、正式分析。Jing Yuan：撰写——审阅与编辑、资源管理、正式分析、数据管理。Yuntao Li：监督、软件、资源管理。Zhiyong Li：验证、监督、资源管理。Yuhe Wang：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目协调。Jianhan Lin：撰写——审阅
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国大学科学基金（2025TC010）和中国农业大学2115人才发展计划的支持。
