《Mucosal Immunology》：Depletion of CX3CR1+ macrophages results in disrupted functionality and immune surveillance within epididymis and testis
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本研究聚焦男性生殖道免疫稳态调控，针对附睾与睾丸中关键的CX3CR1+巨噬细胞开展功能解析。研究人员通过构建转基因小鼠模型实现特异性巨噬细胞耗竭，发现其缺失会导致附睾上皮完整性破坏、精子成熟障碍及睾丸生精功能受损。在UPEC感染模型中，巨噬细胞耗竭小鼠表现出免疫应答失控及组织损伤加剧。该研究揭示了组织驻留巨噬细胞在维持男性生殖健康中的核心作用，为免疫性不育诊疗提供新靶点。
男性生育能力的维持依赖于睾丸和附睾这两个相邻器官的精密协作。睾丸作为免疫豁免区，负责精子的生成；而附睾则承担着精子成熟和储存的重任。然而，附睾并非免疫豁免器官，其腔内容纳着大量具有自身抗原性的精子，同时又需要应对潜在病原体的上行感染。这种独特的微环境要求附睾建立一套精密的免疫调节机制：既要维持对精子的免疫耐受，又要保留强大的抗菌防御能力。一旦这种平衡被打破（特别是由急性细菌感染引发时），往往会导致长期生育障碍——约40%的附睾炎患者会面临持续性的生育力下降问题。
近年来，研究逐渐揭示附睾作为一种黏膜组织，其免疫结构具有明显的区段特异性。在附睾上皮细胞间，分布着大量的CX3CR1+巨噬细胞（单核吞噬细胞），它们是最主要的上皮相关免疫细胞群体。特别是在附睾起始段（精子进入附睾的入口处），这些巨噬细胞会伸出长长的突起穿梭于相邻上皮细胞之间，直达管腔附近，暗示其可能扮演着“哨兵”角色，负责监控管腔内容物。尽管这些巨噬细胞占据着如此战略性的位置，但它们在维持附睾免疫平衡中的具体功能，特别是它们是否对区域免疫稳态具有因果性作用，尚缺乏系统性的研究。
为了回答这一关键科学问题，由C. Pleuger领导的研究团队在《Mucosal Immunology》上发表了最新研究成果。他们通过构建Cx3cr1CreER/+Rosa26iDTR/tdTomato转基因小鼠模型，实现了对CX3CR1+巨噬细胞的特异性耗竭。研究人员采用他莫昔芬（Tam）诱导白喉毒素受体（DTR）表达，间隔14天后给予白喉毒素（Dtx）处理的策略，旨在特异性靶向清除较为稳定的上皮内巨噬细胞群体，而避免影响寿命较短的单核细胞和中性粒细胞。
研究结果显示，在稳态条件下，耗竭CX3CR1+巨噬细胞会导致附睾出现局灶性上皮损伤，特别是在S2、S5/6和S8区段。虽然起始段（巨噬细胞最密集的区域）未观察到明显的上皮破坏，但上皮高度显著降低，提示分泌功能受损。更值得关注的是，从附睾尾获取的精子表现出自发顶体反应（AR）率显著升高，而酪氨酸磷酸化水平（精子获能的分子标志）却显著降低，表明精子成熟过程严重受损。
在睾丸中，巨噬细胞耗竭同样带来了显著影响。研究发现主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II+）巨噬细胞亚群被特异性清除，导致生精过程紊乱，表现为圆形精子细胞从生精上皮脱落， elongated（伸长）精子细胞数量减少，以及在减数分裂阶段（第XII期）凋亡的生精细胞增加。每日精子产量（DSP）显著降低。同时，血清睾酮水平也明显下降，但促黄体生成素（LH）浓度保持不变，提示睾酮合成障碍源于睾丸局部（可能涉及莱迪希细胞功能异常），而非下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的调控异常。
当研究团队使用尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染巨噬细胞耗竭小鼠，模拟急性细菌性附睾炎时，观察到了更为显著的免疫失调现象。与对照组相比，巨噬细胞耗竭小鼠的免疫反应更为剧烈，发病时间更早，组织损伤更严重。特别值得注意的是，在正常情况下受到保护的附睾近端区域（如起始段和头段）也出现了严重的上皮损伤、上皮细胞脱落、间质免疫细胞浸润和精子外渗。转录组分析进一步揭示，巨噬细胞耗竭小鼠在感染后，与免疫调节、抗菌防御相关的基因表达显著下调，表明CX3CR1+巨噬细胞在限制过度炎症反应中发挥着关键作用。
有趣的是，巨噬细胞群体在耗竭后能够逐渐恢复。约30天后，附睾和睾丸中的巨噬细胞数量基本恢复正常。然而，新募集的巨噬细胞在表型上与原驻细胞存在差异：它们表达更高水平的CCR2（提示其可能来源于单核细胞），而MHC-II的表达则有所降低（提示抗原提呈能力可能减弱）。尽管组织形态学有所恢复，但精子成熟功能的缺陷却持续存在，表明再生的巨噬细胞群体可能无法完全替代原驻细胞的功能。
主要技术方法概述
本研究关键技术包括：利用Cx3cr1CreER与Rosa26iDTR/tdTomato小鼠杂交获得转基因模型，通过他莫昔芬诱导和白喉毒素处理实现CX3CR1+细胞特异性耗竭；建立UPEC株CFT073诱导的急性细菌性附睾炎小鼠模型；采用流式细胞术结合t-SNE降维分析免疫细胞群体；通过组织学染色（Masson-Goldner三色法、PAS法）和免疫荧光染色评估组织病理变化；利用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析和基因集富集分析（GSEA）；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测激素水平和抗精子抗体（ASA）；采用功能性精子分析评估精子获能和顶体反应。
研究结果详述
建立特异性耗竭附睾上皮内CX3CR1+巨噬细胞的小鼠模型
研究人员成功建立了一种转基因小鼠模型，能够选择性耗竭附睾内的CX3CR1+巨噬细胞。通过流式细胞术验证，Dtx处理后1天，附睾近端和远端区域以及睾丸中的tdTomato+（Tom+）细胞数量显著减少。免疫荧光染色证实，Tom+细胞几乎全部为F4/80+CX3CR1+巨噬细胞，表明该策略具有高度特异性。值得注意的是，Dtx处理主要清除了上皮内巨噬细胞，而对间质中的巨噬细胞影响较小。高维分析显示，tdTomato荧光信号特异性地局限于CX3CR1+巨噬细胞，在其他免疫细胞群中未见表达。
CX3CR1+巨噬细胞缺失导致附睾局灶性上皮损伤和精子成熟障碍
巨噬细胞耗竭后，附睾形态在初期看似正常，但在Dtx介导的耗竭后10天达到高峰，在S2、S5/6和S8段出现明显的局灶性组织损伤。令人惊讶的是，巨噬细胞最密集的起始段并未出现明显的上皮破坏，但上皮高度显著降低，提示分泌功能受损。在更远端区域，高达10%的上皮区域出现结构损伤，表现为上皮完整性丧失、固缩的上皮细胞、上皮细胞脱落、未成熟生殖细胞在附睾管腔中积聚以及精子外渗到间质空间。免疫荧光染色进一步证实了上皮完整性的丧失。尽管在耗竭后30天，大体形态似乎有所恢复，但顶端AQP9层和EPCAM完整性表现出持续性损伤。重要的是，耗竭CX3CR1巨噬细胞的小鼠在生理条件下30天后并未产生抗精子抗体。
CX3CR1+巨噬细胞耗竭对睾丸巨噬细胞池的影响
鉴于睾丸巨噬细胞也表达CX3CR1，研究人员考察了耗竭策略对睾丸巨噬细胞池的影响。流式分析显示，总体免疫细胞（CD45+）数量减少了约20%，其中约40%的免疫细胞显示tdTomato标记。当区分MHC-II+和MHC-II-巨噬细胞时，MHC-II+亚群主要被tdTomato标记，因此被Dtx选择性耗竭，而MHC-II-巨噬细胞基本未受影响。
CX3CR1+巨噬细胞缺失导致精子发生和类固醇生成受损
详细的组织学分析揭示了生精过程不同阶段的改变。在巨噬细胞耗竭的小鼠中，早期单倍体生殖细胞（圆形精子细胞）在I–III期和IV–VI期经常从生精上皮脱落，elongated（伸长）精子细胞显著减少，表明生精输出降低。在精子释放后的第IX期，顶端生精上皮积聚了凋亡细胞和碎片。在第二次减数分裂的第XII期，凋亡的精母细胞增加，提示生殖细胞分化缺陷和减数分裂进程受损。尽管所有生精阶段在所有时间点都存在，但每日精子产量显著降低。同时，类固醇生成也受损，血清睾酮水平显著降低，但LH浓度保持不变，表明睾酮产生受损发生在睾丸水平。
再生的巨噬细胞群与原群体存在差异
在耗竭后30天，先前被清除的生态位被巨噬细胞重新填充，这些巨噬细胞在表型水平上与Tam-only对照组小鼠相似。然而，高维分析显示，新募集的巨噬细胞在免疫细胞聚类中的位置与对照组不同。在附睾和睾丸中，MHC-II+巨噬细胞不仅在耗竭中不成比例地受到影响，而且在再生后表现出显著降低的MHC-II表达。此外，一部分CX3CR1+巨噬细胞表现出升高的CCR2表达，表明单核细胞来源的细胞部分参与了巨噬细胞池的再生。
CX3CR1+巨噬细胞的耗竭及随后功能失调的再生共同导致附睾对细菌感染的免疫反应加剧
用UPEC感染巨噬细胞耗竭小鼠后，在感染后第10天，耗竭了CX3CR1+上皮内巨噬细胞的小鼠表现出显著增强的免疫反应，特别是在正常情况下对UPEC感染无反应的附睾近端区域。加剧的免疫反应特征为严重的上皮损伤、上皮细胞脱落、间质免疫细胞浸润和精子外渗。转录分析显示，与先天免疫调节、脂多糖反应、I型干扰素产生的负调控、NLRP3炎症小体激活和对外部刺激反应相关的基因在巨噬细胞耗竭小鼠的附睾近端区域显著下调。
研究结论与意义
本研究通过特异性耗竭CX3CR1+巨噬细胞，确凿地证明了这群细胞在维持附睾和睾丸免疫稳态中的核心作用。在稳态条件下，它们对维持上皮完整性、支持精子正常成熟和睾丸激素生成至关重要。在感染条件下，它们则是限制过度炎症、保护组织免受免疫病理损伤的关键调节者。
研究的深刻见解在于揭示了组织驻留免疫细胞的区域特异性功能。附睾不同区段的巨噬细胞可能具有不同的功能偏倚：近端巨噬细胞可能更倾向于维持耐受和上皮屏障功能，而远端巨噬细胞则更具“哨兵”特性，准备应对病原体挑战。这种功能特化使得附睾能够巧妙地平衡其双重使命：保护脆弱的精子免受免疫攻击，同时有效防御入侵的病原体。
此外，巨噬细胞耗竭后虽然数量得以恢复，但其表型和功能的改变（如MHC-II表达下降、CCR2表达升高），以及随之而来的功能异常（如精子成熟障碍持续存在），提示组织驻留巨噬细胞的“教育”和“印记”对于其发挥正常功能至关重要。单核细胞来源的新巨噬细胞可能无法完全“继承”原驻细胞的功能程序。
这项研究不仅深化了我们对男性生殖道免疫学的理解，也为临床提供了重要启示。附睾炎是导致男性不育的常见原因，其背后往往涉及免疫失调。靶向附睾内的特定巨噬细胞亚群，或调节其功能，可能成为治疗免疫性不育的新策略。同时，研究也提示，在应对感染或炎症时，保护或促进组织驻留巨噬细胞的功能，对于维持生殖健康可能具有重要意义。
