《Neurobiology of Disease》：Patient-derived neural organoids reveal developmental impairments associated with a novel GJB1 mutation in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease
编辑推荐：
本研究针对X连锁腓骨肌萎缩症（CMTX1）致病机制不明的难题，通过构建携带新型GJB1（c.554C>T）突变的患者特异性iPSC及3D神经类器官模型，发现该突变导致连接蛋白32（Cx32）内质网滞留和神经分化延迟，为CMTX1中枢神经系统受累机制提供了新型人源化研究平台。
当我们谈论遗传性周围神经病变时，X连锁腓骨肌萎缩症1型（CMTX1）始终是一个绕不开的重要课题。这种由GJB1基因突变引起的疾病，不仅导致患者出现进行性四肢无力、感觉减退等典型周围神经症状，更特别的是，约10%的患者还会表现出中枢神经系统（CNS）异常，包括短暂性脑病、共济失调等神经功能缺损。然而，由于缺乏能够真实模拟人类神经发育过程的研究模型，科学家们对GJB1突变如何同时影响周围和中枢神经系统的机制一直知之甚少。
传统的动物模型虽然提供了一些线索，但物种间髓鞘形成、神经传导特性的差异限制了其临床转化价值。随着诱导多能干细胞（iPSC）技术的成熟，特别是三维脑类器官模型的发展，研究者终于获得了能够模拟人类大脑发育的强大工具。在这项发表于《Neurobiology of Disease》的研究中，Jianying Guo团队报道了一个中国CMTX1家系中发现的新型GJB1错义突变（c.554C>T, p.Thr185Ile），并利用患者来源的iPSC和神经类器官模型，首次揭示了该突变对神经发育的深远影响。
关键技术方法
研究团队首先通过产前诊断获取携带GJB1突变的胎儿脑组织，并利用成纤维细胞重编程建立患者特异性iPSC系。通过胚胎体自发分化验证其多能性后，采用Qian等人建立的forebrain-enriched神经类器官分化方案构建3D模型。实验核心包括免疫荧光染色分析蛋白定位、Lucifer Yellow微注射评估间隙连接功能、RNA测序进行转录组分析，以及组织学染色观察形态学变化。所有胎儿组织样本均来自北京大学第三医院经伦理批准和知情同意的终止妊娠病例。
2.1 新型GJB1变异的鉴定与功能表征
研究人员在一个CMTX1受累家系中鉴定出GJB1基因c.554C>T杂合突变，产前诊断证实胎儿携带该突变。生物信息学分析显示该变异被预测为“可能致病”。在HeLa细胞中的过表达实验表明，突变型Cx32蛋白出现内质网滞留和表达量下降，免疫荧光定量显示平均荧光强度降低，Pearson共定位系数升高，提示蛋白 trafficking 受损。
2.2 GJB1变异诱导的脑组织转录组改变
对孕23周胎儿脑组织的RNA测序分析发现，突变样本与对照组呈现明显转录组分离。基因集富集分析显示细胞连接、上皮-间质转化等通路异常。胎儿脑类器官（FeBO）模型显示突变组有异常细胞黏附趋势，整合分析鉴定出354个差异表达基因，包括细胞黏附相关基因上调和神经发育基因下调。
2.3 GJB1-MUT iPSC系的建立与表征
研究成功将患者成纤维细胞重编程为iPSC，核型分析显示正常46,XY，免疫荧光证实多能性标志物表达。微注射实验显示突变iPSC的Lucifer Yellow扩散面积减少，表明间隙连接功能受损。
2.4 GJB1突变导致iPSC来源神经类器官发育延迟
三维神经类器官分化实验显示，突变类器官体积增大但结构紊乱，神经玫瑰花结形成受损。免疫染色显示GJB1信号点状分布减少，SOX2+神经祖细胞增多而TBR2+中间祖细胞减少，提示神经分化受阻。
2.5 转录组分析揭示GJB1-MUT类器官神经元分化受损
转录组分析发现突变类器官中2070个基因上调和1034个基因下调，富集通路包括神经管发育、亨廷顿病等。增殖标志物Ki67在突变类器官中表达升高且分布紊乱，神经干细胞标志物表达紊乱提示分化异常。跨模型整合分析鉴定出MEIS1、NEUROD1等共同差异基因。
结论与讨论
本研究首次利用患者来源的神经类器官模型揭示GJB1（c.554C>T）突变通过引起Cx32蛋白内质网滞留和表达下调，导致神经分化延迟和细胞连接异常。该突变位于第四个跨膜结构域（TM4），该区域变异通常与更严重的临床表现相关。研究建立的GJB1突变类器官模型不仅为CMTX1中枢神经系统受累机制研究提供了新视角，也为后续药物筛选和基因治疗策略开发提供了重要平台。值得注意的是，GJB1相关神经症状常由生理应激诱发，提示该突变可能造成神经系统的潜在脆弱性而非明显发育异常。未来通过等基因对照或更多患者样本验证，将进一步提高研究结论的可靠性。
