基于对称衍射位移的无镜头自动对焦技术，用于高通量全幅图像扫描

《Optics & Laser Technology》：Lensless autofocusing based on symmetric diffraction shifts for high-throughput whole-slide imaging

提出了一种基于无透镜的两射照明自动对焦方法，通过计算对称角度下衍射图像的横向位移估计轴向失焦，结合四角平面校正实现全局焦点一致性，显著提升高吞吐量整片成像的效率，平均绝对焦点误差0.56微米，优于传统机械对焦方式。

　　

吴华正|唐万杰|蔡阳晨|曹天浩|黄星茹|吴家驹|张继勇|吴伟|江少伟|郭成飞

杭州电子科技大学通信工程学院，中国杭州310018

摘要

自动对焦是高通量全切片成像（WSI）中的一个主要瓶颈。高数值孔径（NA）物镜可以提供亚微米级的分辨率，但只有微米级的景深。传统的机械自动对焦需要密集的Z轴堆栈采集和精确的运动控制，这严重限制了扫描吞吐量并增加了系统成本。在这里，我们提出了一种两步无透镜自动对焦方法，该方法用计算估计来替代轴向搜索，基于对称的衍射位移。使用可编程LED阵列，从两个对称角度照射样本，并捕获两张无透镜衍射图像。通过相位相关性估计两个衍射图案之间的横向位移，并通过校准的线性模型将其映射到轴向离焦，从而仅用两帧图像就能重建全场对焦图。为了确保全局对焦一致性，我们结合了基于罗德里格斯旋转的四角平面校正程序，以补偿转塔切换和样本安装引入的倾斜和曲率。在多种组织类型和染色条件下的实验验证了这种方法的通用性。在四个独立样本上，该方法的平均绝对对焦误差为0.56微米，远低于20×/0.75NA物镜的0.8微米景深，并且与机械Z轴堆栈自动对焦相比，对焦吞吐量提高了两个数量级以上。H&E和IHC染色样本的全切片成像进一步证明了该方法的稳健性和实用性。所提出的框架为数字病理系统提供了一种紧凑、低成本且具有物理可解释性的自动对焦解决方案。

引言

组织病理学检查仍然是疾病诊断的临床金标准[1]，它依赖于在光学显微镜下对染色组织切片的视觉评估[2]。尽管全切片成像（WSI）实现了病理工作流程的数字化，并促进了定量分析和人工智能辅助诊断，但其整体吞吐量仍然受到缓慢且机械强度高的对焦采集过程的限制[3]、[4]。高数值孔径（NA）物镜对于解析亚细胞结构至关重要，但只能提供微米级的窄景深。组织切片不可避免地表现出厚度不均匀、局部变形和安装引起的曲率，这要求在扫描过程中每个视野（FOV）都需要重新对焦。因此，自动对焦（AF）已成为限制WSI系统效率、稳健性和可扩展性的主要瓶颈[5]、[6]。

已经开发了多种AF策略，但没有一种能够完全满足精度、速度、简单性和与现有显微镜架构兼容性的竞争需求[2]。传统的机械AF方法沿轴向采集一系列图像，并使用对比度、梯度或基于频率的指标来评估对焦[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。这些方法虽然可靠，但速度较慢，因为它们需要多次采集和精确的电机定位。基于间隔的AF通过在选定的FOV进行对焦测量来减轻采集负担，但当组织表面高度变化迅速时会导致失败[14]。基于硬件的AF引入了辅助传感器或成像路径——如双摄像头配置、分束反射测量或倾斜光学探针——以实时跟踪对焦位置[5]、[15]、[16]。虽然这些设计显著加快了对焦过程，但它们增加了光学复杂性、校准工作量和系统成本，通常使得与商用显微镜的集成变得困难。基于深度学习的AF成为另一个有前景的方向[17]、[18]。这些方法估计对焦位置[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]，或直接从离焦测量生成对焦图像[27]、[28]、[29]。尽管它们具有潜力，但由于严重依赖大型标注数据集、对未见过的组织类型或染色协议的泛化能力有限，以及缺乏物理可解释性，限制了其在临床环境中的应用。此外，它们在分布外样本上的性能可能会下降——这在病理学中是常见的情况。无透镜成像和可编程照明的最新发展为计算显微镜提供了新的机会。衍射图案本质上编码了3D信息，多角度或多孔径照明可以揭示空间频率或条纹结构的深度依赖性变化[30]、[31]。然而，以往的研究主要集中在相位恢复、超分辨率重建或多模态成像[32]、[33]上。衍射图案用于直接、定量自动对焦估计的潜力尚未得到系统探索，现有方法也没有提供一种快速、机械独立且与大视野WSI系统兼容的机制。特别是，如何从最小化的数据中提取稳定、易于校准的轴向信息仍然是一个未解决的挑战。

为了解决这些限制，我们提出了一种用于高通量WSI的两步无透镜自动对焦方法。使用可编程LED阵列，从两个对称角度照射样本，并捕获两张无透镜衍射图像。我们证明，这两个衍射图案之间的横向位移提供了一个稳健且物理可解释的线索，用于估计轴向离焦，从而仅用两帧图像即可实现自动对焦。与旨在图像重建的传统无透镜成像方法不同，所提出的方法仅将衍射图案作为轴向波前信息的物理载体用于自动对焦估计，而不是重建图像。这种方法将传统的基于Z轴堆栈的AF转换为由衍射位移分析驱动的计算任务，消除了对机械轴向扫描或额外光学硬件的需求。此外，WSI需要在厘米级组织切片上保持全局对焦一致性。为了确保这种对齐，我们结合了基于罗德里格斯旋转的四角平面校正程序，以补偿转塔切换、样本安装或制造公差引入的全局倾斜或曲率。这一步将预对焦图与明场参考平面对齐，确保整个切片的准确对焦。这项工作的主要贡献体现在三个方面。我们首先开发了一种紧凑且低成本的两步自动对焦架构，用基于物理的计算策略取代了机械Z轴堆栈采集，对焦吞吐量提高了两个数量级以上。此外，我们建立并实验验证了在不同组织类型和染色条件下横向像素位移与轴向离焦之间的高度一致性的线性关系，提供了一个稳定且物理可解释的对焦估计模型。进一步地，通过结合基于罗德里格斯旋转的四角平面校正程序，我们确保了大面积组织范围内的全局对焦一致性，使得所提出的方法能够可靠地集成到实际的全切片成像系统中。通过全面的实验，我们展示了所提出的框架在连续扫描过程中实现了亚微米级的对焦精度和高稳健性，为下一代数字病理平台提供了一个实用且可扩展的解决方案。

部分摘录

光学配置和成像原理

所提出的自动对焦模块集成在一个配备了可编程角度照明阵列的传统全切片成像平台上。如图1(a)所示，由位于聚光器下方的可编程LED阵列生成两个对称的倾斜照明，入射角分别为$+\theta$和$-\theta$。样本直接放置在像素间距为$p$的CMOS图像传感器下方，样本与传感器的距离为$d$。这种紧凑的无透镜配置共享相同的光学路径

实验和结果

所提出的WSI系统的实验原型如图4所示。该设置集成了三个功能模块：照明模块、自动对焦（AF）模块和明场成像模块。尼康20×/0.75NA物镜与标准管镜（TTL200，Thorlabs）和彩色CMOS相机（DFK 33UX183）结合，形成了明场成像通道。AF通道使用安装在定制3D打印转塔适配器上的单色CMOS相机（DMK 33UX183）。

两个成像模块都是

讨论与结论

上述结果表明，所提出的两步无透镜自动对焦技术能够实现WSI的准确、高通量对焦。通过用基于对称衍射位移的计算估计替代机械Z轴堆栈扫描，该方法将传统的耗时轴向搜索转换为横向位移测量问题。这种几何变换显著提高了对焦效率，同时保持了亚微米级的精度。

CRediT作者贡献声明

吴华正：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草案，方法论，概念化。唐万杰：验证，软件，数据管理。蔡阳晨：可视化，软件，方法论，数据管理。曹天浩：形式分析。黄星茹：监督。吴家驹：可视化，形式分析。张继勇：监督。吴伟：验证，方法论。江少伟：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。郭成飞：软件，

资助

本工作得到了浙江省自然科学基金（LR25F050003）、浙江省属高校基本科研业务费（GK249909299001-014）、浙江省重点研发计划（2025C01197(SD2)）和中国国家自然科学基金（62305258, 62575228）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。