《Plant Physiology and Biochemistry》：BoMYB96 and BoMYB2 positively regulate seed germination by inhibiting the transcription of
BoABI5
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本研究揭示了甘蓝（Brassica oleracea）中两个R2R3-MYB转录因子BoMYB96和BoMYB2在脱落酸（ABA）信号通路中的新功能。研究人员通过系列实验证实，BoMYB96和BoMYB2能够直接结合ABA信号核心调控因子BoABI5的启动子并抑制其转录，从而降低种子对ABA的敏感性，显著提高拟南芥（Arabidopsis thaliana）和甘蓝型油菜（Brassica napus）在ABA处理下的萌发率。该研究不仅深化了对ABI5转录调控网络的理解，也为作物抗逆育种提供了新靶点。
种子是植物生命的起点，其萌发过程受到内外信号的精密调控。在这个关键阶段，植物激素脱落酸（Abscisic Acid, ABA）扮演着"刹车"角色，通过抑制萌发帮助植物躲避不利环境。然而，过强的ABA信号也会阻碍农作物正常生长，影响农业生产。因此，解析ABA信号转导途径，特别是其核心调控因子ABI5（Abscisic Acid Insensitive 5）的精细调控机制，成为植物科学领域的重要课题。
ABI5作为bZIP家族转录因子，在ABA介导的种子萌发抑制过程中起核心作用。虽然已知多种蛋白可通过调控ABI5蛋白稳定性来影响ABA信号，但对其转录水平的调控机制，特别是上游转录因子的作用仍知之甚少。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，其中MYB96和MYB2已被报道参与ABA信号转导，但它们是否以及如何调控ABI5转录，在甘蓝类蔬菜中尚未明确。
针对这一科学问题，陕西省杂交油菜研究中心的沈震、黄淑华等研究人员在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了最新研究成果。他们发现甘蓝中的两个R2R3-MYB转录因子BoMYB96和BoMYB2能够直接结合BoABI5启动子并抑制其转录，从而正调控种子萌发。这一发现不仅揭示了ABA信号通路中新的调控模块，也为作物遗传改良提供了理论依据。
研究人员运用了多种关键技术方法开展此项研究。实验材料包括哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）、甘蓝型油菜K407品系和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）。通过同源序列比对和系统进化分析验证基因保守性；利用亚细胞定位确定蛋白分布；采用酵母单杂交（Y1H）和凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与DNA的直接结合；通过双荧光素酶报告基因（Dual-LUC）和GUS活性实验检测转录调控活性；在拟南芥和甘蓝型油菜中过表达目标基因并进行表型分析；使用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测基因表达水平。
3.1. 同源序列比对和生物信息学分析
通过序列比对发现，BoMYB96和BoMYB2含有MYB家族特征性的R2R3保守结构域。三维蛋白结构预测显示它们与拟南芥同源蛋白AtMYB96和AtMYB2高度相似。系统进化树分析进一步表明BoMYB96和BoMYB2在不同物种间具有保守性。
3.2. BoMYB96和BoMYB2的亚细胞定位
通过构建35S:BoMYB96-GFP和35S:BoMYB2-GFP表达载体并在本氏烟草叶片中瞬时表达，发现BoMYB96和BoMYB2的绿色荧光蛋白（GFP）信号特异性地定位于细胞核，表明这两种转录因子在细胞核中发挥功能。
3.3. BoMYB96和BoMYB2的转录活性分析
利用酵母系统检测转录活性，将BoMYB96和BoMYB2全长编码序列克隆至pGBKT7载体并转化酵母细胞。结果显示，转化pGBKT7-BoMYB96和pGBKT7-BoMYB2的酵母能在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上生长，且在含有X-α-gal的培养基上变蓝，证明BoMYB96和BoMYB2具有转录激活活性。
3.4. 外源ABA对野生型和转基因拟南芥萌发率的影响
在含有不同浓度ABA（0、0.25 μM、0.5 μM、1 μM）的1/2 MS培养基上培养野生型拟南芥和过表达BoMYB96或BoMYB2的转基因株系。结果显示，在无ABA条件下，各基因型种子萌发无显著差异；但在ABA存在时，转基因株系的萌发率和子叶绿化率显著高于野生型，表明BoMYB96和BoMYB2降低了拟南芥对ABA的敏感性。
3.5. 外源ABA对野生型和转基因甘蓝型油菜萌发率的影响
比较发现BoABI5和BnaC04.ABI5启动子序列高度保守。在甘蓝型油菜K407背景中过表达BoMYB96和BoMYB2，在25 μM ABA处理下，转基因株系的萌发率显著高于野生型。qRT-PCR分析显示，在ABA处理下，转基因株系中BnaC04.ABI5的表达水平明显低于野生型，证实过表达BoMYB96和BoMYB2能抑制ABI5转录。
3.6. BoMYB96和BoMYB2可与BoABI5启动子结合
通过酵母单杂交实验发现，BoMYB96和BoMYB2能与BoABI5启动子直接相互作用。分段验证将结合区域定位至起始密码子（ATG）上游-116 bp区域。凝胶阻滞实验进一步证实BoMYB96和BoMYB2蛋白可直接结合该启动子区域。
3.7. BoMYB96和BoMYB2抑制BoABI5转录
双荧光素酶报告基因实验显示，共表达BoMYB96/BoMYB2与BoABI5启动子时，荧光素酶活性显著降低。GUS活性实验也得到一致结果：BoMYB96和BoMYB2能抑制BoABI5启动子驱动的GUS表达。这些证据共同表明BoMYB96和BoMYB2是BoABI5的转录抑制因子。
本研究系统阐明了BoMYB96和BoMYB2在ABA信号通路中的新功能。这两种转录因子通过直接结合BoABI5启动子并抑制其转录，负调控ABA信号转导，从而促进种子萌发。这一发现完善了ABI5转录调控网络，揭示了MYB转录因子在ABA信号通路中的上游调控作用。
研究的意义不仅在于基础理论层面，更在于其潜在的应用价值。在农业生产中，ABA介导的种子休眠是影响作物出苗一致性的关键因素。通过调控MYB96/MYB2-ABI5模块，有望实现种子萌发特性的精准调控，培育出既能适时萌发又保持必要抗逆性的作物新品种。此外，该研究为理解植物如何在逆境信号与生长发育之间实现平衡提供了重要线索，为作物抗逆育种提供了新思路和靶点基因。
值得注意的是，BoMYB96和BoMYB2结合在BoABI5启动子的-116 bp至ATG区域，这与已报道的其他MYB蛋白结合位点不同，可能代表了一种新的调控模式。未来研究可进一步探索这一调控模块在不同作物中的保守性，以及其在植物整体抗逆性调控网络中的位置和作用机制。
