《Poultry Science》：Two kinds of novel reassortment H3 subtypes of avian influenza viruses: similar genetic composition, different mammalian transmission capabilities
编辑推荐：
本研究针对新型H3亚型禽流感病毒(AIV)对家禽业和公共卫生的潜在威胁，通过对分离自不同地区的四株H3N3和一株H3N8病毒进行全基因组测序、系统发育树和同源性分析，并选取代表性毒株在SPF鸡、BALB/c小鼠和Hartley豚鼠中研究其致病性和传播性。结果显示，H3N3病毒的八个基因片段源自H3N8病毒(HA基因)、H10N3病毒(NA基因)和H9N2病毒(内部基因)的重配，而H3N8毒株的基因片段则是H3N8病毒(HA和NA基因)与H9N2病毒(内部基因)重配的结果。动物实验表明，B166 (H3N3)和K245 (H3N8)分离株对SPF鸡和BALB/c小鼠均具有致病性，并能感染Hartley豚鼠。两种毒株均能在鸡群中传播，但仅K245能通过直接接触在豚鼠间传播。这凸显了H3亚型病毒的潜在公共卫生风险，强调了持续监测和深入研究的重要性。
禽流感(Avian Influenza, AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)引起的人畜共患病，主要影响家禽，但也能感染包括人类在内的多种哺乳动物。AIV根据其对鸡的致病性可分为高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Low Pathogenicity Avian Influenza Virus, LPAIV)。H3亚型AIV是一种分离率较低的LPAIV，持续存在于多种鸟类中，削弱其对机会性病原体的抵抗力并影响生产性能，从而持续威胁家禽业。当H3亚型AIV与其他亚型AIV共存时，可能导致病毒重配，产生新的AIV毒株。近年来，H3N8和H9N2亚型AIV之间的内部基因重配导致了一种新型H3N8病毒的出现，该病毒在家禽群体中广泛传播并随后溢出感染人类。尽管人类感染病例仍然散发，但这表明H3N8亚型AIV能够跨越种间屏障感染哺乳动物宿主，引发了人们对H3亚型AIV未来是否可能成为重大公共卫生威胁的担忧。
中国拥有世界上最密集的家禽生产和活跃的活禽市场(Live Poultry Markets, LPMs)，为AIV的进化事件提供了理想的生态舞台。为了评估新型H3亚型AIV对家禽业和人类健康的潜在威胁，华南农业大学的研究团队在《Poultry Science》上发表了最新研究成果。他们通过持续的AIV监测，分离到四株新型重配H3N3毒株和一株新型重配H3N8毒株。基于分离结果，本研究选取代表性毒株，研究其对鸡和小鼠的致病性，以及在鸡和Hartley豚鼠中的传播性，旨在深入了解并从理论上评估其对公共卫生的潜在威胁。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们从广东省活禽市场及其他省份兽医站和农场系统收集了819份样本，通过鸡胚接种进行病毒分离，并使用血凝和血凝抑制(Haemagglutination and Haemagglutination Inhibition, HA-HI)试验初步鉴定样本。全基因组测序采用两步法RT-PCR和通用引物扩增病毒基因组。系统发育分析通过从GISAID和NCBI数据库获取2000年至2024年的AIV序列，使用MAFFT进行多序列比对，并利用IQ-TREE构建最大似然系统发育树。病毒分子特征分析包括关键氨基酸位点分析和使用NetNGlyc 1.0在线工具预测潜在糖基化位点。动物实验则在SPF鸡、BALB/c小鼠和Hartley豚鼠中进行，评估病毒的致病性和传播能力。
鉴定结果
在2022年10月至2023年5月期间，对中国多地区家禽养殖场和活禽市场的常规监测中，从819份样本中分离到四株H3N3和一株H3N8 AIVs，均来源于鸡。
全基因组遗传进化分析
基因组水平的系统发育分析显示，五株分离的AIV毒株的HA基因聚类在欧亚分支内，与三株人源H3N8 AIV毒株属于同一分支。六种内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M和NS）的遗传进化分析表明，分离株与H9N2亚型AIV聚类在同一分支，且与人源H3N8亚型AIV毒株具有密切的进化关系。
分子特征分析
五株H3亚型毒株的HA蛋白裂解模式均为PEKQTR↓GIF，未发现连续碱性氨基酸，这是低致病性AIV的分子特征。所有分离株均携带与病毒致病性、聚合酶活性、哺乳动物受体亲和力增强相关的PB2突变（I292V、G309D、K318R、I333T、R477G、I495V）。PB1突变（L13P、V171M、R198K、H436Y、L473V）和I368V提示对哺乳动物的适应性增强和雪貂传播能力提升。PA基因突变E133K、L295P和F666L与小鼠致病性增强相关，N383D增强鸭的致病性和传播性。NP基因突变M105V增强鸡的致病性。M1基因突变N30D和T215A以及M2基因突变L69P与小鼠致病性增强相关。NS基因突变D97E可能增强人类致病性。所有分离株的HA肽链上均发现5个保守的N-糖基化位点（38、54、181、301和499位）。
病毒在SPF鸡中的复制、致病性和传播性
选择一株H3N3分离株（B166）和一株H3N8分离株（K245）进行SPF鸡的毒力和传播性测定。两种新型H3亚型AIV均能通过口腔和泄殖腔排毒，在鸡的呼吸系统中有效复制，并能通过直接接触传播到同居组。气管中的病毒滴度高于肺部，表明其对上呼吸道复制的偏好。在肺外器官（心、肝、脾、肾和脑）中也检测到少量病毒，表明其具有广泛的组织嗜性和在鸡中引起全身感染的潜力。B166在呼吸系统中的病毒复制略强于K245，表明H3N3亚型AIV对鸡的侵袭性更高。但在14 dpi时，部分同居SPF鸡的血清抗体水平略低，表明其传播性略弱于H3N8亚型。
病毒在BALB/c小鼠中的复制和致病性
评估新型重配H3 AIV对哺乳动物和人类健康的潜在风险。感染小鼠出现轻度临床症状。体重测量显示，在感染初期1-3天，B166（H3N3）和K245（H3N8）感染组体重明显减轻，随后逐渐恢复，表明其具有中等但非致死性的毒力水平。器官组织病毒载量和14 dpi特异性血清抗体水平评估表明，两种新型H3亚型在BALB/c小鼠中表现出明显的呼吸道嗜性。B166毒株在肺部复制效率最高，感染仅限于呼吸系统。K245毒株尽管在肺部复制较弱，但在肾脏和脾脏中达到了相当的病毒滴度，表明其具有更广泛的组织嗜性，但仍主要集中于呼吸道。
病毒在Hartley豚鼠中的传播性
研究新型H3N3 AIV和成分相似的H3N8 AIV在哺乳动物间接触传播的潜在风险。感染后豚鼠出现打喷嚏和流鼻涕等临床症状。在两个感染组的鼻洗液中均检测到病毒滴度，K245的排毒时间略长于B166。在K245同居组中，三只豚鼠全部感染并排毒，而在B166同居组中未检测到病毒滴度。血清抗体结果证实了两个感染组的感染和病毒排毒，但仅K245同居组的三只豚鼠均显示抗体阳性。这些发现表明，新型H3N3 AIV分离株可以感染豚鼠，但尚未具备在它们之间传播的能力。
研究结论与意义
本研究中分离的H3N3 AIV是由H3N8、G57基因型H9N2和H10N3病毒基因重配产生的低致病性新型流感病毒。H3N8 AIV的八个基因片段包括来自H3N8毒株的HA和NA基因，以及与H9N2毒株重配的内部基因。两种亚型分离株在鸡和小鼠中表现出广泛的组织嗜性。在鸡中，它们主要通过口腔和泄殖腔排毒，并可通过空气传播在鸡群中扩散。新型H3N8 AIV可通过直接接触在豚鼠间传播，而H3N3亚型分离株目前尚不具备此能力。然而，H3N3 AIV毒株在理论上仍保留感染哺乳动物的潜力，对公共卫生构成潜在威胁。
该研究强调了持续监测H3亚型AIV的重要性，特别是关注其内部基因（尤其是源自H9N2病毒的基因）中出现的哺乳动物适应性突变。这些突变可能显著增强病毒在哺乳动物中的复制能力和毒力。研究还指出，尽管H3N3和H3N8病毒具有高度相似的基因组成，但其NA基因来源的不同（H3N3源自H10N3，H3N8源自H3N8）可能导致其在哺乳动物模型（如豚鼠）中传播能力存在显著差异，这突显了NA蛋白在病毒传播中的关键作用。深入了解NA蛋白结构变异如何影响病毒传播性的差异，以及HA与NA蛋白之间的功能平衡如何影响病毒在哺乳动物宿主中的适应性，是未来重要的研究方向。这些发现为制定AIV防控政策提供了科学依据，对防范潜在的人畜共患病疫情具有重要意义。
