《iScience》：CircRNA Cdyl promotes the proliferation and differentiation of neural stem cells via regulating miR-544-3p/Nr3c1 axis
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本研究聚焦于认知功能障碍的治疗难题，研究人员围绕环状RNA Cdyl (circCdyl)在神经干细胞(NSC)命运决定中的作用展开探索。结果表明，circCdyl在NSC增殖分化过程中及海马穹窿-海马伞(FF)横断后表达上调，其过表达可通过海绵吸附miR-544-3p进而上调Nr3c1表达，从而促进NSC增殖和神经元分化，并在体内有效促进海马神经发生、改善认知功能。该研究为神经系统疾病提供了新的潜在治疗靶点。
认知功能障碍，包括进行性记忆丧失，与海马体功能受损密切相关。在成年大脑中，海马体齿状回(DG)是一个特殊的微环境，负责新生神经元的生成。随着阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病的进展，海马体中新生神经元的数量和成熟度会显著下降，这可能加剧认知缺陷。因此，探寻促进内源性神经发生、修复受损神经环路的策略，成为神经科学领域的重要挑战。神经干细胞(NSCs)因其自我更新能力和分化为功能神经元的潜力，被视为修复中枢神经系统损伤的理想细胞来源。然而，如何精确调控NSCs的增殖和定向分化，仍是亟待解决的关键科学问题。
近年来，环状RNAs (circRNAs)作为一种内源性非编码RNA，因其稳定的环状结构和重要的基因调控功能而备受关注。研究表明，circRNAs在脑中富集，并以组织特异性、发育阶段依赖性的方式表达，在神经发生、突触可塑性等大脑关键生理过程中扮演重要角色。其中，竞争性内源RNA (ceRNA)机制是circRNA行使功能的重要方式之一，即circRNA通过充当microRNA (miRNA)的“分子海绵”，间接调控下游靶基因的表达，从而影响细胞命运。
此前研究发现，去神经支配的海马组织来源的外泌体能够促进NSCs向神经元分化，并且通过RNA测序(RNA-seq)鉴定出外泌体中差异表达的circRNAs，其中circRNA Cdyl (circCdyl)的表达上调最为显著。circCdyl是由Cdyl基因的第5号外显子反向剪接形成。然而，circCdyl在NSCs中的生物学功能尚不明确。为了深入探究circCdyl是否以及如何调控NSCs的增殖与分化，并进一步影响认知功能，研究人员在《iScience》上发表了这项研究成果。
为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们从胚胎期15天(E15)的SD大鼠海马体中分离并培养了原代NSCs。通过构建circCdyl过表达慢病毒载体，在体外和体内（SD大鼠海马体定点注射）实现circCdyl的调控。研究采用了qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞术、CCK-8法、荧光原位杂交(FISH)、双荧光素酶报告基因检测等技术，系统评估了circCdyl对NSC增殖、细胞周期、神经元分化的影响。同时，通过穹窿-海马伞(FF)横断手术建立大鼠认知功能障碍模型，并利用Morris水迷宫和穿梭箱实验评估其认知行为学改变。此外，还通过生物信息学分析预测并实验验证了circCdyl/miR-544-3p/Nr3c1这一ceRNA调控轴。
Identification and characterization of circular RNAs Cdyl
研究人员首先鉴定并表征了circCdyl。他们通过设计反向引物扩增并测序证实了circCdyl在NSCs中的存在。实验表明，circCdyl对 oligo(dT)18 引物不敏感，且比线性Cdyl mRNA更稳定，能抵抗RNase R消化，证实了其环状特性。在NSCs增殖和分化过程中，circCdyl的表达量随时间推移逐渐增加。同样，在大鼠FF横断后的海马组织中，circCdyl的表达也在第7天达到峰值。
Circular RNAs Cdyl promotes neural stem cell proliferation and differentiation into neurons
为了探究circCdyl的功能，研究人员在NSCs中过表达了circCdyl。流式细胞术分析显示，过表达circCdyl后，处于S期的细胞比例显著增加。CCK-8实验进一步证实circCdyl增强了NSCs的增殖能力。免疫荧光染色显示，Nestin阳性的NSCs中Ki67阳性细胞的比例升高。当诱导NSCs分化时，过表达circCdyl显著提高了神经元标志物Tuj1、MAP2和NeuN的表达水平，并促进了细胞向神经元的分化，但对星形胶质细胞分化无显著影响。
Circular RNAs Cdyl promotes the recovery of cognitive function after fimbria-fornix transection
为了评估circCdyl对认知功能的影响，研究人员将过表达circCdyl的慢病毒显微注射到SD大鼠的海马体中。行为学实验结果表明，在Morris水迷宫中，circCdyl过表达组大鼠找到平台的潜伏期和路径长度缩短，穿越原平台位置的次数增加。在穿梭箱实验中，circCdyl过表达组大鼠的主动回避次数也显著多于对照组。这些结果说明，circCdyl能够改善FF横断后大鼠的认知功能障碍。
Circular RNAs Cdyl promotes hippocampal neurogenesis
进一步的分子和形态学分析发现，circCdyl过表达后，海马组织中神经元标志物Tuj1、MAP2和NeuN的蛋白表达水平上调。免疫荧光染色显示，海马齿状回中BrdU+细胞（增殖细胞）、Tuj1+细胞（未成熟神经元）以及NeuN+/BrdU+细胞（新生神经元）的数量均显著增加。这表明circCdyl在体内能够促进海马神经发生。
Circular RNAs Cdyl directly binds to miR-544-3p and suppresses miR-544-3p activity
接下来，研究人员深入探讨了circCdyl的作用机制。通过结合多种生物信息学算法（circAtlas, RNAhybrid, miRanda）和RNA-seq数据，他们预测miR-544-3p是circCdyl的潜在靶点。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-544-3p能够抑制野生型circCdyl的荧光素酶活性，但对突变体无影响。荧光原位杂交(FISH)显示circCdyl与miR-544-3p在NSCs中存在共定位。这些结果证明circCdyl能够直接结合并抑制miR-544-3p的活性。
Circular RNAs Cdyl, coordinated with miR-544-3p, regulates neural stem cell proliferation and differentiation
功能回复实验表明，过表达miR-544-3p会抑制NSCs的增殖和神经元分化，而抑制miR-544-3p则产生相反的效果。更重要的是，同时过表达circCdyl能够逆转miR-544-3p过表达对NSC增殖和分化的抑制作用。这证实了circCdyl是通过调控miR-544-3p来行使功能的。
miR-544-3p targets Nr3c1
研究人员进一步寻找miR-544-3p的下游靶基因。通过TargetScan和miRDB数据库预测结合RNA-seq分析，他们筛选出18个候选靶基因，并最终验证了核受体亚家族3组C成员1 (Nr3c1)是miR-544-3p的直接靶标。双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western blot结果均证实miR-544-3p可靶向抑制Nr3c1的表达。免疫荧光显示Nr3c1在海马齿状回的颗粒层富集，且在FF横断后第7天表达显著上调。
Circular RNAs Cdyl regulates Nr3c1 by sponging miR-544-3p to promote neural stem cell proliferation and differentiation
最后，研究人员构建了完整的ceRNA调控轴。他们发现，过表达Nr3c1可促进NSCs增殖和神经元分化，而敲低Nr3c1则抑制这些过程。miR-544-3p过表达能够抑制Nr3c1的促增殖和促分化作用。此外，circCdyl过表达能协同增强Nr3c1的功能。这些结果最终证实了“circCdyl/miR-544-3p/Nr3c1”轴在调控NSC命运中的关键作用。
综上所述，本研究首次揭示了一条由circCdyl介导的ceRNA新通路：circCdyl通过海绵吸附miR-544-3p，解除其对靶基因Nr3c1的抑制作用，进而促进神经干细胞的增殖和向神经元的分化。在动物模型中，上调circCdyl能够有效促进海马神经发生，并改善因FF横断导致的认知功能障碍。该研究不仅深化了对circRNA在神经发生中调控作用的理解，更重要的是，为治疗认知障碍相关的神经系统疾病（如阿尔茨海默病、脑损伤等）提供了一个潜在的创新性治疗靶点。未来，针对circCdyl/miR-544-3p/Nr3c1轴的干预策略，或许有望成为促进脑内神经再生、修复神经功能的新希望。当然，该研究也存在一些局限性，例如尚需直接证据证明体内改变miR-544-3p是否影响认知功能，以及持续上调Nr3c1是否会带来其他生理变化等，这些都将成为后续研究的方向。
