基于黏连蛋白聚类修饰因子的筛选揭示基因组三维折叠调控新机制

《SCIENCE ADVANCES》：A genetic screen for modifiers of cohesin clustering identifies regulators of genome folding

本研究发现通过成像为基础的遗传筛选手段，成功鉴定出7个NIPBL样和10个WAPL/PDS5样黏连蛋白（cohesin）调控因子。研究证实这些因子通过调控染色质结合黏连蛋白水平、线粒体功能及表观沉默等机制影响基因组三维结构，为理解黏连蛋白介导的DNA环挤出（loop extrusion）、CTCF锚定环稳定等关键过程提供了新视角。该筛选策略为解析基因组折叠调控网络提供了重要资源。

　　

研究背景与意义

基因组在细胞核内的精确折叠对基因表达调控和DNA修复至关重要。黏连蛋白复合体作为基因组三维结构的主要组织者，通过染色质加载、DNA环挤出、挤出停滞和染色质卸载等多个步骤调控基因组空间构象。然而，调控这些步骤的上游分子机制尚不明确。前期研究表明黏连蛋白聚类现象与其染色质滞留时间及环挤出活性相关，这为开发新型筛选策略提供了理论基础。

研究方法创新

本研究构建了WAPL条件性降解细胞系（HCT116:WAPL-AID），通过部分降解黏连蛋白卸载因子WAPL建立敏感背景，利用高通量成像技术开发了基于黏连蛋白聚类表型的遗传筛选平台。该平台采用384孔板培养体系，通过RAD21免疫荧光染色、高内涵共聚焦显微镜自动成像及图像分析流程，实现了对7638个可成药基因的系统性筛选。

筛选结果验证

初级筛选鉴定出80个抑制因子（NIPBL样）和38个增强因子（WAPL/PDS5样）。通过多轮正交验证实验，包括CRISPR-Cas9介导的WAPL敲除、siRNA共敲降等策略，最终确认7个NIPBL样因子（如PHC2、BCAS2）和10个WAPL/PDS5样因子（如NDUFB4、KAT2B）能稳定调控黏连蛋白聚类。小分子抑制剂实验和CRISPR敲除实验进一步验证了筛选结果的可靠性。

机制探索发现

1. 1.
   基因组折叠调控：通过高吞吐量DNA荧光原位杂交（HiDRO）技术检测6个拓扑关联域（TAD）对的相互作用，发现多个筛选因子能显著改变TAD间距离，证明其对基因组三维结构的调控作用。
2. 2.
   染色质结合水平：蛋白质印迹分析显示，BCAS2和SLC35A3（NIPBL样）降低染色质结合黏连蛋白水平，而TRAF7和NDUFB4（WAPL/PDS5样）则增加其水平，提示这些因子可能通过调控黏连蛋白负载机制发挥作用。
3. 3.
   蛋白互作网络：免疫共沉淀实验发现PHC2、BCAS2与黏连蛋白复合体组分存在直接相互作用，KAT2B特异性结合NIPBL。特别值得注意的是，经典多梳抑制复合体1（cPRC1）组分与黏连蛋白存在特异性互作，提示表观沉默机制可能直接参与黏连蛋白功能调控。
4. 4.
   CTCF聚类分化：通过分析CTCF聚类表型，发现TRAF7表现出类似PDS5的特征——增强黏连蛋白聚类但抑制CTCF聚类，这为区分不同功能的黏连蛋白调控因子提供了新指标。

生物学意义与展望

本研究建立的筛选平台突破了传统Hi-C技术的通量限制，为系统解析黏连蛋白调控网络提供了重要工具。发现的调控因子涉及线粒体功能（NDUFB4）、乙酰化修饰（KAT2B）、剪接调控（BCAS2）和表观沉默（PHC2）等多个生物学过程，表明黏连蛋白功能受到多途径精密调控。特别值得注意的是：

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  线粒体复合体I抑制剂罗滕酮能增强黏连蛋白聚类，提示能量代谢与基因组结构存在新型关联
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  cPRC1与黏连蛋白的直接互作为理解多梳蛋白在基因组空间组织中的作用开辟了新方向
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  PDS5样因子通过调控CTCF锚定环稳定性的发现，为解释黏连蛋白挤出停滞机制提供了新视角

这些发现不仅深化了对黏连蛋白工作机制的理解，更为相关发育疾病和癌症的机制研究提供了新的分子靶点和理论框架。未来研究可聚焦于解析特定因子调控黏连蛋白环挤出速率、染色质滞留时间等精细机制，以及这些调控过程在疾病发生中的具体作用。