G6PT1磷酸偶联葡萄糖-6-磷酸转运的结构基础与绿原酸抑制机制解析

《SCIENCE ADVANCES》：Structural insight into the glucose-6-phosphate transport by G6PT1 and inhibition mechanism of CGA

本研究通过解析G6PT1在apo状态、结合底物G6P/共底物磷酸及抑制剂CGA的冷冻电镜结构，揭示了磷酸偶联G6P转运的分子机制，发现CGA通过竞争底物结合并稳定胞质面构象实现抑制，为GSD1b致病机制研究和糖尿病治疗药物开发提供了关键结构依据。

　　

在维持血糖稳态的生命活动中，肝脏的糖原分解和糖异生途径扮演着核心角色。这两条代谢途径的终产物葡萄糖-6-磷酸（G6P），需要被转运至内质网（ER）腔内，经葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（G6PCs）水解生成葡萄糖，最终释放入血。负责这一关键转运步骤的是葡萄糖-6-磷酸转运体1（G6PT1，亦称SLC37A4）。G6PT1的功能异常与严重的代谢紊乱密切相关：其完全且慢性的功能丧失会导致一种罕见的遗传性代谢疾病——糖原贮积病1b型（GSD1b），患者表现为血糖稳态失衡、中性粒细胞减少及功能障碍；而适度、可逆地抑制G6PT1的活性，则能够减少肝脏葡萄糖输出，成为治疗2型糖尿病的一种潜在策略。然而，长期以来，G6PT1如何特异性识别其底物G6P和共底物磷酸（P_i），以及如何利用磷酸耦合完成G6P转运的分子机制，特别是天然抑制剂绿原酸（CGA）如何发挥作用，这些关键科学问题仍未被阐明，制约了针对该靶点的精准药物设计。

为了回答这些基础且重要的问题，研究团队在《SCIENCE ADVANCES》上发表了最新研究成果。研究人员利用哺乳动物HEK293F细胞表达系统，制备了全长人源G6PT1蛋白。通过基于微粒体的磷酸释放实验，他们首先对G6PT1的转运功能进行了表征，确认其具有典型的转运活性。随后，研究团队运用单颗粒冷冻电镜技术，成功解析了G6PT1在多种状态下的高分辨率结构：包括apo状态（空载）、结合底物G6P的状态（胞质面构象）、结合共底物磷酸（P_i）的状态（腔面构象），以及与抑制剂CGA复合的状态（胞质面构象）。这些结构清晰地展示了G6PT1作为主要协助超家族转运蛋白的典型折叠特征，并揭示了其在不同功能状态下的构象变化。研究过程中，团队还发现并验证了在去垢剂LMNG中形成的二聚体可能是一种人工假象，而非生理性寡聚体，进而采用纳米盘技术重构样品，获得了更接近生理状态的单体结构，确保了研究结果的可靠性。

G6P识别和转运

研究人员解析的G6PT1^G6P复合物结构显示，G6PT1采用胞质面构象，其中心存在一个带正电荷的腔室，用于容纳带负电的G6P分子。G6P的磷酸基团与R28^TM1、K64^TM2形成盐桥，并与Y21^TM1、Y60^TM2、Y233^TM7等残基形成氢键。葡萄糖基团则与W118^TM4、W138^TM5、S142^TM5、H366^TM11等残基相互作用。功能实验证实，这些关键残基的突变会显著削弱或完全 abolish G6P的转运活性。与腔面构象的G6PT1^OUT结构比较发现，转运过程中C结构域相对于N结构域发生了约40°的旋转，像“摇椅开关”一样，交替将底物结合腔暴露于胞质侧或腔侧，从而实现G6P从胞质向ER腔的转运。

磷酸耦合G6P转运的机制

G6PT1的活性严格依赖于ER腔内的磷酸。G6PT1^Pi结构显示，磷酸离子结合在靠近G6P磷酸基团的位置，由TM1、TM2、TM4、TM11上的残基协调，包括与Y60^TM2的氢键和与H366^TM11的潜在相互作用。结构比较表明，在腔面构象下，磷酸的结合会与G6P竞争相同的结合位点或引起局部构象变化，从而促进G6P在ER腔内的释放，这解释了磷酸如何作为共底物驱动G6P转运的逆交换过程。

G6PT1被CGA抑制的机制

CGA是一种天然多酚化合物，已知是G6PT1的有效抑制剂。G6PT1^CGA结构显示，CGA结合在G6PT1的胞质面构象的正电荷腔室内，其奎尼酸部分朝向腔面，咖啡酸部分朝向胞质面。CGA通过其羟基与K64^TM2、W138^TM5、N354^TM10、H366^TM11形成氢键，并通过疏水相互作用与Y233^TM7、V369^TM11、F134^TM5等残基稳定结合。关键残基如N354L的突变完全消除了CGA的结合。结构比较发现，CGA的结合位置与G6P部分重叠，并且CGA特异性地稳定了G6PT1的胞质面构象，因为其在腔面构象下会与TM10发生空间冲突。这表明CGA通过竞争性抑制G6P结合，并“锁住”转运蛋白处于胞质面构象，阻止其向腔面构象转变，从而发挥抑制作用。

G6PT1中的构象转变

研究还分析了稳定G6PT1不同构象的分子相互作用。在腔面构象（G6PT1^OUT）中，N结构域和C结构域在胞质侧半部靠近，通过D72^TM2、D285^TM8与邻近螺旋N末端的电荷-偶极相互作用，以及R126^TM4与E355^TM10的静电相互作用来稳定。在胞质面构象（如G6PT1^G6P）中，D47^TM2与K389^TM11之间的盐桥对稳定该状态至关重要。破坏这些相互作用的突变会显著损害转运活性，表明这些相互作用对于构象转变的能量平衡和正常转运功能不可或缺。

综上所述，这项研究通过高分辨率结构生物学手段，首次全面揭示了G6PT1转运G6P的精细分子机制、磷酸耦合的驱动力原理以及天然抑制剂CGA的作用模式。这些发现不仅为理解G6PT1在血糖稳态中的核心作用提供了原子水平的视角，而且对相关人类疾病具有重要的转化意义。一方面，该研究为阐释GSD1b上百种致病性突变如何影响G6PT1的折叠、稳定性、底物识别或构象转变提供了结构框架，有助于该遗传病的分子诊断和潜在治疗策略的开发。另一方面，清晰地揭示了CGA作为选择性抑制剂的结合位点和作用机制，为基于结构的合理设计更高效、低毒的G6PT1抑制剂用于糖尿病治疗奠定了坚实的基础，展示了结构生物学在推动精准医学发展中的强大力量。