人源AQP11三聚体冷冻电镜结构揭示其大孔径通道特征与内质网水转运新机制

《SCIENCE ADVANCES》：Cryo-EM structure of human AQP11 reveals a trimeric architecture with a large pore

本研究针对内质网定位水通道蛋白AQP11的结构与功能机制这一长期未解之谜，通过高分辨率冷冻电镜技术解析了其2.3 ?三级结构，首次揭示AQP11形成独特的三聚体架构，并发现其具有比经典水通道更宽、更疏水的孔道及独特的NPC选择性过滤模体。该结构为理解AQP11在肾脏发育中的关键作用及设计特异性抑制剂提供了分子蓝图。

　　

水是生命活动的基础，生物膜上的水分子快速转运主要由水通道蛋白（Aquaporin，AQP）家族介导。这个蛋白家族根据其底物选择性可分为三类：严格选择水分子的经典水通道（如AQP0、1、2、4、5）、同时转运水和甘油等小分子的水甘油通道蛋白（如AQP3、7、9、10），以及特性尚不明确的第三类（包括AQP11和AQP12）。与定位在细胞膜上的大多数AQP不同，AQP11主要位于内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）膜上。基因敲除研究表明，AQP11的缺失会导致小鼠出生后出现致命性多囊肾，提示其在肾脏早期发育和功能中扮演着关键角色。然而，关于AQP11的确切转运功能一直存在争议。早期研究认为它是水通道，但后续实验结果相互矛盾，也有研究提示它可能转运甘油、过氧化氢（H₂O₂）或其他溶质。更引人注目的是，AQP11的第一个NPA模体（Asn-Pro-Ala）被替换成了NPC模体（Asn-Pro-Cys），这一变化在传统AQP中对质子排斥和水选择性至关重要。由于缺乏高分辨率结构信息，这种替换的结构与功能意义，以及AQP11的亚细胞定位和底物特异性的分子基础，长期以来一直笼罩在迷雾之中。

为了揭开AQP11的神秘面纱，研究人员在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上发表了最新成果。他们利用先进的冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了嵌入月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG）胶束中的人源AQP11（hAQP11）结构，分辨率高达2.3 ?。这项研究为了解AQP11独特的转运机制和生理功能提供了前所未有的分子见解。

本研究主要运用了以下关键技术方法：利用Expi293 BacMam表达系统生产hAQP11蛋白；通过尺寸排阻色谱和荧光检测尺寸排阻色谱验证蛋白的寡聚化状态和稳定性；采用基于JEM-Z320FHC电子显微镜的第八代冷冻电镜系统进行数据采集；使用RELION和cryoSPARC软件进行图像处理和三维重构；通过将蛋白重构至脂质体并结合停流光谱技术测定其水和甘油渗透性。

整体结构

研究最出乎意料的发现是，hAQP11形成了独特的同源三聚体结构，这与所有已知的四聚体AQP截然不同。每个单体呈现典型的AQP折叠，包含6个跨膜螺旋（H1-H6）和5个连接环（A-E）。此外，在N端还观察到一个额外的跨膜螺旋H0，这使得AQP11总共拥有7个跨膜螺旋。这种拓扑结构明确了其N端朝向ER腔、C端朝向胞质的方向，修正了先前细胞生物学实验的结论。三聚体的中央轴被疏水残基阻塞，不太可能作为渗透途径，其中观察到的未鉴定密度可能源于稳定三聚体组装的脂类分子。结构比较和AlphaFold 3预测均强烈支持三聚体是AQP11的固有属性，而非去垢剂引起的人工假象。N端螺旋H0的存在被认为是阻止其形成四聚体的关键因素，因为H0会与相邻原体中的H2发生空间冲突。

三聚体界面

对三聚体界面相互作用的详细分析揭示了其组装机制与经典AQP四聚体不同。在经典AQP中，界面由原体的H1和H2与相邻原体的H4和H5形成。而在AQP11中，界面涉及一个原体的H0和H2与相邻原体的H4和H5相互作用，形成了特征性的三聚体界面。疏水相互作用主要发生在ER腔侧的H0与H4之间，以及胞质侧的H0与H6之间。三聚体界面的核心则由H2和H4之间广泛的疏水相互作用定义。值得注意的是，在经典AQP四聚体组装中起关键作用的H1，在AQP11三聚体形成中不发挥作用。

结构比较

每个AQP11单体包含一个长约30 ?的孔道。与经典AQP相比，其选择性过滤器由一组独特的氨基酸（Thr⁶¹, Val⁸², Val²⁰⁴, Ala²¹³, Leu²¹⁹）构成，缺乏经典的芳香族/精氨酸（ar/R）模体。这使得AQP11的孔道即使在最窄处直径也达到4 ?，比任何已知AQP都更宽，且疏水性更强。这种宽大且相对均匀的孔道半径源于其独特的选择性过滤器组成以及H2螺旋向外偏移约4.5 ?。序列比对显示，经典AQP中H1胞外侧高度保守的小侧链丝氨酸或甘氨酸（如AQP4的Ser⁵⁵）在AQP11中被体积较大的亮氨酸（Leu⁶⁴）取代，其侧链产生的空间位阻迫使相邻的H2外移，从而扩大了孔道整体半径。此外，AQP11的胞外环结构也与其他AQP亚家族不同。研究发现AQP11在环C上的Cys¹⁵⁵和环E上的Cys²²⁷之间形成了一个以前未报道的二硫键，这可能有助于稳定其三聚体结构。尽管第一个NPA模体被NPC模体取代，但该区域的三维结构与其他AQP惊人地保守。然而，NPC模体中的Cys¹⁰¹侧链似乎通过空间位斥使H6螺旋相对于AQP4外移约6 ?，这可能是影响其功能的重要因素。

功能分析

为了验证AQP11的功能，研究人员将其重构至脂质体中，并通过停流光谱法测量渗透性。结果表明，与空脂质体对照相比，AQP11脂质体在渗透压梯度下表现出显著更高的水渗透速率和甘油渗透速率，证实了AQP11作为水和甘油渗透通道的功能，具有水甘油通道蛋白的特性。

疾病相关突变的结构基础

该cryo-EM结构为阐释致病突变如何导致先天性肾病综合征和多囊肾提供了直接的结构框架。将已知致病突变映射到结构上，揭示了其不同的功能障碍机制：例如，p.Pro¹⁵⁸Ser突变可能破坏环C的精确拓扑和邻近的二硫键，导致蛋白不稳定；p.Trp²⁶⁰Cys突变会破坏原体间界面的疏水相互作用， destabilize三聚体状态；而单核苷酸多态性rs2276415（Gly¹⁰²Ser）则可能通过使丝氨酸的羟基朝向底物渗透孔而改变底物渗透性。对小鼠中天然存在的Cys²²⁷Ser突变的分析表明，该突变会破坏Cys¹⁵⁵-Cys²²⁷二硫键，损害蛋白正确折叠，与观察到的未折叠蛋白反应和细胞凋亡一致。

结论与意义

本研究首次通过高分辨率冷冻电镜解析了AQP11的结构，揭示了其独特的同源三聚体架构和额外的N端跨膜螺旋H0，这些特征标志着AQP11遵循了独特的进化路径。其宽大、疏水且缺乏典型收缩点的孔道结构，结合其ER定位，提示其生理功能可能不仅限于水转运，而是优化用于转运像H₂O₂这样更大的分子，以适应ER内生物合成和代谢的需求。该原子结构为了解AQP11的功能特异性提供了分子框架，并为未来基于结构的药物设计以开发特异性抑制剂或激活剂、进而精确探究其在生理和病理条件下的功能奠定了基础，为开发新的治疗策略带来了希望。