根瘤共生调控因子NIN通过NLP遗传基序获得广谱DNA结合特异性的分子机制

《SCIENCE ADVANCES》：The root nodule symbiosis regulator NIN exhibits broad DNA binding specificity conferred by an NLP-inherited motif

本研究针对转录因子NIN如何获得调控根瘤共生(RNS)特异性功能这一关键科学问题，通过结构生物学、生物化学和遗传学方法，鉴定出NIN蛋白RWP-RK结构域下游的FR基序可稳定二聚体界面，从而拓宽其DNA结合特异性。该发现揭示了NIN从NLP家族演化过程中的分子适应机制，为理解共生固氮的起源提供了新视角。

　　

在自然界中，豆科植物与根瘤菌建立的根瘤共生关系(RNS)是生物固氮的重要途径，对全球氮循环和农业生产具有重大意义。NODULE INCEPTION (NIN)转录因子作为该过程的"总指挥"，调控着根瘤菌侵染、根瘤发育和固氮基因表达等关键环节。然而，一个长期悬而未解的问题是：NIN蛋白如何从庞大的NIN-LIKE PROTEIN (NLP)转录因子家族中脱颖而出，获得了调控根瘤共生的特异性功能？

以往研究表明，NIN虽然与NLPs共享RWP-RK DNA结合结构域，但其DNA结合特异性明显更广，能够识别更多类型的顺式元件。这种特性使得NIN能够调控一系列根瘤共生相关基因的表达，而其他NLPs则主要参与硝酸盐响应等基础代谢过程。科学家们推测，正是这种DNA结合特异性的差异，可能是NIN功能特异化的关键所在，但其中的分子机制一直是个谜团。

为了揭开这个谜底，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了一项突破性研究。他们通过多学科交叉的方法，发现了一个名为FR（RWP-RK下游基序）的关键功能区域，该基序通过稳定RWP-RK二聚体界面，显著拓宽了NIN的DNA结合能力。这一发现不仅解释了NIN功能特异化的结构基础，还揭示了根瘤共生演化的分子轨迹。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：通过系统发育分析和序列比对鉴定保守基序；利用电泳迁移率实验(EMSA)评估蛋白质-DNA相互作用；采用尺寸排阻色谱(SEC)和化学交联实验分析蛋白质寡聚化状态；基于AlphaFold2/3进行蛋白质二聚体和蛋白质-DNA复合物的结构预测；通过分子动力学(MD)模拟研究蛋白质构象动态变化；运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建突变体植株；结合转录组测序(RNA-seq)和实时定量PCR分析基因表达模式。

鉴定决定NIN广谱DNA结合特异性的基序

研究人员通过比较不同植物物种中NINs/NLPs的氨基酸保守性，发现在RWP-RK结构域下游存在一个15个氨基酸的基序，命名为FR。嵌合蛋白实验表明，将LjNLP4的FR替换到LjNIN中后，后者对部分非偏好顺式元件的结合能力显著下降；反之，将LjNIN的FR引入LjNLP4后，该蛋白获得了结合这些元件的能??。这些结果证明FR^NIN是决定NIN广谱DNA结合特异性的关键因素。

DNA结合模块具有形成二聚体的能力

研究人员发现，仅包含RWP-RK和FR的DNA结合模块在体外实验中仍能形成二聚体，且这种二聚化在DNA存在下得到增强。尺寸排阻色谱和蓝绿原生电泳结果显示，这些模块主要以单体形式存在，但部分会发生二聚化，而化学交联实验证实DNA结合能够促进二聚体形成。

FR^NIN通过增强RWP-RK二聚化实现广谱DNA结合特异性

AlphaFold2预测的结构显示，FR^LjNIN通过疏水和范德华力相互作用与RWP-RK的二聚化螺旋结合，形成了额外的二聚界面，而FR^LjNLP4则不具备这种功能。点突变实验进一步验证了这些预测：破坏RWP-RK或FR中的二聚化关键残基，都会显著影响蛋白质的DNA结合能力。分子动力学模拟表明，LjNIN在无DNA状态下能维持适合DNA结合的稳定二聚构象，而LjNLP4则容易失去这种构象。

FR^NIN是NIN调控根瘤共生所必需的

为了验证FR在植物体内的功能，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了FR缺失的?FR nin突变体。与完全丧失结瘤能力的nin-9突变体不同，?FR nin突变体仍能形成根瘤，但这些根瘤呈白色且无法固氮。组织学分析显示突变体根瘤中根瘤菌分布异常，侵染线形成严重受损。基因表达分析表明，虽然NIN靶基因在?FR nin中仍有表达，但其表达时序和水平都发生了改变。

FR揭示了NIN从NLPs演化而来的轨迹

有趣的是，研究人员发现拟南芥AtNLP2也含有NIN型FR，并表现出与LjNIN相似的广谱DNA结合特异性。在莲花中异源表达AtNLP2能够诱导部分NIN靶基因的表达，甚至能在特定条件下引发侵染线和根瘤形成。这表明NIN型FR在非结瘤植物中早已存在，NIN的演化可能是在已有分子特征基础上的进一步功能特化。

这项研究通过对FR基序的发现和功能解析，揭示了NIN获得根瘤共生调控能力的分子机制。研究表明，FR^NIN通过稳定RWP-RK二聚体界面，使NIN能够更有效地结合不同类型的顺式元件，从而调控更广泛的靶基因。这种分子特征在根瘤共生演化之前就已存在于某些NLPs中，说明NIN的功能创新是建立在祖先蛋白已有特性的基础之上。

该研究的创新性在于首次阐明了NIN功能特异化的结构基础，提出了"二聚体界面强化"这一新的转录因子功能演化机制。这不仅深化了我们对根瘤共生分子机制的理解，也为研究转录因子家族的功能分化提供了新范式。未来，基于这些发现可能开发出新的技术手段，用于改良作物的固氮能力或设计人工共生系统，对可持续农业发展具有重要意义。