PKM2通过调控丙酮酸氧化维持CD4+T细胞稳态和扩增存活的新机制

《SCIENCE ADVANCES》：Pyruvate kinase muscle 2 (PKM2) promotes CD4 T cell survival by regulating pyruvate oxidation during homeostasis and expansion

本研究针对CD4+T细胞在稳态维持和扩增过程中易发生线粒体活性氧（mitoROS）介导的细胞死亡这一关键问题，通过药理学激活和T细胞特异性敲除模型，揭示了丙酮酸激酶M2型（PKM2）与PKM1协同调控丙酮酸代谢流向的核心作用。研究发现PKM2缺失会导致组成性激活的PKM1过度表达，驱动丙酮酸过量进入三羧酸循环（TCA cycle）产生致命性mitoROS，而低氧环境可逆转该效应。该研究不仅阐明了PKM2在T细胞免疫代谢中的新功能，还为自身免疫疾病（如结肠炎）的治疗提供了潜在靶点。

　　

在免疫系统这座精密运转的防御工事中，T淋巴细胞如同忠诚的哨兵，时刻准备着识别并清除入侵的病原体。其中，CD4⁺T细胞作为免疫应答的“指挥官”，其数量和功能的稳定对机体免疫力至关重要。当T细胞被激活后，会迅速启动“代谢重编程”，大幅提升葡萄糖摄取和糖酵解速率，以满足其快速增殖的能量和生物合成需求。在这个关键过程中，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）作为糖酵解通路的最后一步限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP，处于代谢流向的十字路口。在T细胞中，PK主要有两种异构体：PKM1和PKM2。PKM1具有组成性高活性，而PKM2则像一个“代谢调节阀”，能在高活性的四聚体和低活性的二聚体之间转换，从而精细调控糖酵解中间产物是用于产生能量还是用于生物合成。尤其值得注意的是，PKM2在活化的T细胞中显著上调，但其在CD4⁺T细胞稳态维持和扩增中的具体作用机制，特别是与传统代谢功能相关的方面，尚不清晰。

以往的研究多聚焦于PKM2在细胞核内的“兼职”功能（如调控基因转录），但其与PKM1协同调控CD4⁺T细胞代谢的核心作用未被充分认识。一个亟待解答的科学问题是：PKM2如何通过调控丙酮酸这一关键代谢节点的流向，影响CD4⁺T细胞的命运？特别是在细胞扩增（伴随高代谢活性）和长期存活（维持稳态）这两个关键阶段，PKM2的作用是否存在差异？解答这一问题对于理解T细胞免疫代谢的基本规律，以及开发针对T细胞过度活化相关疾病（如自身免疫病）的新策略具有重要意义。发表在《SCIENCE ADVANCES》上的这项研究，正是围绕这一核心问题展开。

为了深入探究PKM2在CD4⁺T细胞中的功能，研究人员综合运用了多种关键技术。在基因工程动物模型方面，他们构建了T细胞特异性敲除PKM2的小鼠模型（PKM2^ΔTcell），并通过竞争性骨髓嵌合体实验、胸腺切除术模型以及T细胞过继转移模型，在体内评估PKM2缺失对T细胞发育、稳态维持及致病性的影响。在细胞功能分析层面，研究采用了流式细胞术进行免疫表型分析、细胞死活鉴定、细胞增殖检测以及活性氧（ROS）水平测量。代谢分析是本研究的一大特色，研究人员利用Seahorse细胞能量代谢分析系统实时检测细胞的糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）能力，通过靶向代谢组学分析细胞内代谢物水平，并创新性地使用¹³C标记葡萄糖进行代谢流分析，精确追踪葡萄糖来源的碳原子在糖酵解和三羧酸循环中的流向。此外，组织病理学分析用于评估结肠炎模型的疾病严重程度。这些技术的结合应用，为从分子、细胞、动物模型等多个层面揭示PKM2的功能提供了坚实的数据支撑。

胸腺T细胞亚群具有独特的糖酵解特征

研究人员首先分析了胸腺中不同发育阶段T细胞亚群的PKM表达和代谢特征。他们发现，CD4单阳性（SP4）细胞比其他胸腺亚群（如CD8单阳性SP8细胞）表达显著更高的PKM2蛋白，但PKM总体酶活性并未相应升高，提示SP4细胞中存在大量处于低活性状态的PKM2。代谢物分析显示，SP4细胞具有最高的乳酸水平，而双阴性（DN）细胞则富含三羧酸循环中间产物，表明不同胸腺亚群对丙酮酸的利用方式存在差异。SP4细胞还含有更高水平的抗氧化代谢物，这与高水平无活性PKM2可能通过限制丙酮酸产生来控制ROS水平的假设一致。

PKM2激活剂TEPP-46选择性增加胸腺SP4 T细胞

为了扰动PKM2的活性状态，研究人员使用PKM2特异性激活剂TEPP-46处理小鼠。结果显示，TEPP-46处理选择性地增加了胸腺中SP4细胞的比例和绝对数量，提高了SP4:SP8比值，而对PKM2表达水平较低的SP8细胞没有影响。这表明药理学激活PKM2能够影响胸腺内CD4⁺T细胞的发育。

氧张力是TEPP-46诱导ROS介导的CD4⁺T细胞死亡的核心因素

与在体实验结果相反，在体外用TEPP-46处理经抗CD3/CD28抗体激活的CD4⁺T细胞时，细胞存活率反而下降，且这种死亡并非由于增殖受阻，而是与细胞内ROS水平显著升高有关。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）能够剂量依赖性地挽救TEPP-46诱导的细胞死亡。一个关键发现是，这种由PKM2激活引发的细胞死亡高度依赖于氧环境。在模拟胸腺低氧条件的3% O₂环境下培养时，TEPP-46的促死亡效应被显著逆转。这解释了为何在低氧的胸腺环境中TEPP-46反而促进SP4细胞累积，而在常氧（17% O₂）的体外培养中则导致细胞死亡。

PKM2缺失的CD4⁺T细胞中PKM1的异常表达导致氧化性死亡

为排除TEPP-46的脱靶效应，研究团队利用PKM2^ΔTcell小鼠进行更精确的机制探索。在PKM2缺失的CD4⁺T细胞（CD4 T cells^ΔPKM2）中，PKM1表达代偿性增加。与TEPP-46处理结果类似，激活后的CD4 T cells^ΔPKM2在体外扩增时存活细胞更少，死亡细胞更多，但其增殖能力未受影响。深入机制研究发现，这些细胞虽然总ROS（用DCFDA检测）未升高，但线粒体特异性超氧化物（用MitoSOX Red检测）水平在激活48小时后显著增加。使用线粒体ROS抑制剂MitoTEMPO处理可特异性提高CD4 T cells^ΔPKM2的存活率。同样，在1%或3%的低氧环境下培养，PKM2缺失的CD4⁺T细胞不仅死亡减少，其扩增能力甚至优于对照细胞。这些结果证实，PKM2通过防止由组成性激活的PKM1驱动产生的过量线粒体ROS来保护激活的CD4⁺T细胞。

PKM2缺失的CD4⁺T细胞具有更高的氧化磷酸化和糖酵解能力

RNA测序分析显示PKM2缺失对CD4⁺T细胞的转录组影响甚微，提示其功能主要源于代谢改变。Seahorse代谢分析表明，激活的CD4 T cells^ΔPKM2具有更高的基础糖酵解速率、基础耗氧率、备用呼吸容量以及线粒体ATP产生速率。代谢组学分析发现，这些细胞中糖酵解中间体、磷酸戊糖途径组分和TCA循环中间产物水平均升高。¹³C-葡萄糖示踪实验进一步证实，PKM2缺失细胞将更多的葡萄糖碳导向TCA循环（丙酮酸、柠檬酸、谷氨酸、富马酸、苹果酸、天冬氨酸的¹³C标记比例增加），而非转化为乳酸。这表明在缺乏PKM2“制动”的情况下，葡萄糖碳被不受限制地送入TCA循环，导致线粒体ROS过量产生。

PKM2赋予CD4⁺T细胞长期适应性

尽管PKM2缺失的CD4⁺T细胞在体外能正常分化为各种辅助性T细胞（T_H1, T_H2, T_H17）和诱导性调节性T细胞（iT_reg），但其在体内的长期存活存在严重缺陷。随着小鼠年龄增长（10周后），PKM2^ΔTcell小鼠脾脏中的CD4:CD8 T细胞比值、CD4⁺T细胞比例和绝对数量均显著下降。这种细胞丢失主要发生在氧分压较高的外周组织（脾脏、淋巴结），而在低氧的胸腺中，CD4⁺T细胞比例反而增加。竞争性骨髓嵌合体实验直接证明，PKM2缺失的CD4⁺和CD8⁺T细胞在填充脾脏和淋巴结时处于竞争劣势，CD4⁺T细胞的劣势更为明显。胸腺切除术模型和过继转移实验表明，PKM2缺失并不影响CD4⁺T细胞的稳态增殖能力，但显著损害其长期存活，证明PKM2对于CD4⁺T细胞的稳态维持至关重要。

PKM2加剧CD4⁺T细胞介导的结肠炎病理

在T细胞移植诱导的结肠炎模型中，将PKM2缺失的初始CD4⁺T细胞（CD4⁺CD45RB^hi）过继转移给RAG^(?/?)小鼠后，其诱导的结肠炎严重程度显著轻于对照组。这与PKM2缺失的致病性T细胞在肠系膜淋巴结和结肠浸润数量显著减少直接相关，组织病理学评分也相应降低。这表明致病性CD4⁺T细胞的扩增和存活依赖于PKM2，提示PKM2可能是治疗T细胞驱动性自身免疫病的潜在靶点。

本研究最终得出结论：PKM2与PKM1协同扮演着“代谢调节阀”的关键角色，通过精细控制丙酮酸代谢流向来平衡氧化磷酸化产生的ROS水平。这一机制既能在激活时促进T细胞应答，又能防止ROS过量引发的细胞死亡。研究揭示了氧环境在这一调控过程中的核心作用，并阐明了PKM2在CD4⁺T细胞稳态维持和致病性中的不可或缺性。该发现不仅深化了对T细胞免疫代谢的理解，也为干预T细胞过度活化相关疾病提供了新的代谢检查点思路。