《SCIENCE ADVANCES》：A synthetic Antrodia cinnamomea galactomannan library by frameshift unveils a potent immunoregulatory octasaccharide domain
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本研究针对牛樟芝半乳甘露聚糖免疫调节机制不明确的问题，通过合成化学构建包含11种寡糖的文库，系统解析其构效关系。研究发现八糖化合物4可通过协同抑制MAPK和NF-κB通路显著抑制LPS诱导的炎症因子释放，为开发精准糖免疫疗法提供新思路。
在传统中医药宝库中，牛樟芝（Antrodia cinnamomea）如同一位隐世的免疫调节大师，其抗炎、抗肿瘤等功效早已被记载。然而，这位“大师”的真正法宝——多糖类成分，尤其是结构复杂的半乳甘露聚糖，却因天然提取物的异质性和结构不明确，使得科学家难以揭示其精准的作用机制。就像试图用一把万能钥匙打开多把结构不同的锁，研究人员面临的核心挑战在于：如何获得结构均一、序列明确的糖链，从而建立可靠的构效关系（SAR），并最终指导新型糖类免疫调节剂的开发？
针对这一难题，发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究团队独辟蹊径，他们不再依赖于从天然牛樟芝中艰难地分离提取，而是转向了合成化学这一强大工具。研究团队设计并成功合成了一个包含11个寡糖的牛樟芝半乳甘露聚糖文库。这些寡糖的链长从4糖到24糖不等，但都精确维持了与天然产物一致的75%甘露糖（Mannose, Man）和25%半乳糖（Galactose, Gal）组成。尤为关键的是，该文库通过“框架位移”（frameshift）策略，系统性地包含了所有可能的四糖和八糖连接模式，为深入探究糖链特定“结构域”的免疫调节功能提供了前所未有的精确材料。
关键技术方法
本研究的关键技术核心在于发展了一种高效、高立体选择性的α-半乳糖苷化方法，成功解决了1,2-顺式（1,2-cis）轴向糖苷键构建的难题。基于此，采用模块化合成策略，逐步组装了从四糖到二十四糖的目标分子。免疫学评估则在RAW264.7小鼠巨噬细胞模型上进行，通过检测脂多糖（LPS）刺激下炎症因子IL-6和TNF-α的分泌水平，并结合蛋白质印迹法（Western blot）分析MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白的磷酸化水平，来阐明化合物的免疫调节机制。
研究结果
立体选择性α-半乳糖苷化方法的建立
构建整个寡糖文库的核心挑战在于如何高效、高选择性地形成难度较大的α-半乳糖苷键。研究人员通过系统筛选，发现使用3,4-二-O-苯甲酰基-6-O-叔丁基二苯基硅烷基保护的半乳糖基N-苯基三氟乙酰亚胺酯（PTFAI）或硫苷作为给体，在低温和低浓度条件下，能够与多种类型的糖受体、氨基酸受体以及直链醇受体高效反应，以优异的α-选择性（α:β > 20:1）得到目标α-半乳糖苷。这一方法的建立为后续复杂寡糖的合成奠定了坚实基础。
牛樟芝半乳甘露聚糖文库的构建
基于逆合成分析和已建立的糖基化方法，研究团队成功合成了文库中的所有11个目标寡糖。合成路线以正交保护的三糖为共同关键中间体，通过灵活的糖基化策略，分别构建了作为侧链和主链的四糖模块。进而，通过[4 + 4]糖基化反应，将不同的四糖模块组合，合成了四个具有框架位移差异的八糖。最终，通过八糖的迭代糖基化，成功合成了包含三个重复单元的二十四糖（1），这是目前化学合成的最大的牛樟芝半乳甘露聚糖类似物。所有全保护寡糖经过三步去保护（脱硅、酯交换、全局氢解/叠氮还原）后，以良好至优秀的产率得到了最终的目标分子。
免疫学评估揭示八糖结构域的关键作用
免疫学实验结果表明，所合成的半乳甘露聚糖寡糖（25和100 μM）均能以剂量依赖的方式显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞产生白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。值得注意的是，八糖（3至6）的整体抑制活性强于其对应的四糖形式（8至11）以及更大的十六糖（2）和二十四糖（1），提示延长至八糖的结构可能产生了协同效应。其中，八糖化合物4表现出最强的免疫抑制活性，对IL-6和TNF-α产生的抑制率分别高达90.76%和57.35%。
机制研究阐明化合物特异性通路调控
为了深入探究活性分子作用机制，研究人员选取活性最显著的八糖4及其对应的四糖10和保守单元7进行信号通路研究。蛋白质印迹分析显示，这三种寡糖均能抑制LPS诱导的p38蛋白磷酸化（p-p38），即抑制了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，且抑制强度与它们的免疫抑制活性正相关（4 > 10 > 7）。然而，在核因子κB（NF-κB）通路方面，只有八糖4能够独特地抑制LPS诱导的p65蛋白磷酸化（p-p65）的上调。这表明，虽然其亚基四糖7和10主要通过衰减MAPK通路发挥作用，但八糖4能够同时影响MAPK和NF-κB两条关键炎症通路，展现出“1 + 1 > 2”的协同效应和化合物特异性的作用机制。细胞活性实验证实所有合成化合物在测试浓度下均无明显细胞毒性。
研究结论与意义
本研究通过精妙的合成化学策略，成功构建了一个结构精确、覆盖所有可能框架位移模式的牛樟芝半乳甘露聚糖寡糖文库，并首次合成了二十四糖大小的类似物。系统的构效关系研究不仅揭示了八糖作为关键免疫调节“结构域”的重要性，更发现了明星分子八糖4通过协同抑制MAPK和NF-κB通路发挥强效免疫调节活性的独特机制。这项工作将天然产物的结构复杂性转化为可精确研究的化学实体，为理解糖类分子与免疫受体的相互作用机制提供了分子基础，极大地推动了基于碳水化合物的免疫疗法（糖免疫疗法）的理性设计与发展。
