《Molecular Therapy Oncology》：Strategically engineering an oncolytic herpes simplex virus to improve systemic delivery
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本研究针对溶瘤病毒(OV)系统给药面临单核吞噬细胞系统(MPS)清除和中和抗体(NAb)两大瓶颈，开发了经基因工程改造的溶瘤疱疹病毒FusOn-SD。该病毒通过展示CD47胞外区(ECD)以逃避MPS吞噬，并经过血清传代筛选获得强效NAb抵抗能力。临床前研究表明，FusOn-SD能有效靶向肿瘤并显著抑制生长，为转移性癌症的全身性病毒治疗提供了新策略。
癌症至今仍是全球范围内导致死亡的主要原因之一，尽管免疫疗法等新兴手段带来了希望，但针对已发生转移的恶性肿瘤，治疗选择依然有限。溶瘤病毒治疗（Oncolytic Virotherapy, OV）作为一种利用病毒选择性感染并裂解肿瘤细胞的策略，近年来显示出巨大潜力。目前已有几种溶瘤病毒获得临床批准，例如2015年美国FDA批准的T-VEC（一种改造的1型单纯疱疹病毒，HSV-1）以及更早在中国获批的安柯瑞（H101，一种溶瘤腺病毒）和2021年在日本获批的Teserpaturev (G47Δ)。然而，这些疗法主要依赖于瘤内注射，极大地限制了其在治疗多发转移灶或深部肿瘤中的应用。将病毒通过静脉注射等全身性方式递送，是攻克这一难题的关键，但病毒在血液循环中会遭遇两大“天敌”：一是体内的单核吞噬细胞系统（Mononuclear Phagocyte System, MPS，主要包括巨噬细胞等）会迅速清除病毒颗粒；二是患者体内可能存在的中和抗体（Neutralizing Antibodies, NAbs，或因既往感染产生，或因治疗诱发），能使病毒失活。因此，如何打造一款能够突破这两重障碍、实现高效全身递送的“超级”溶瘤病毒，成为了该领域的研究热点。
为了解决这一难题，研究人员在《Molecular Therapy Oncology》上发表了他们的最新成果。他们基于此前开发的溶瘤2型单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus type 2, HSV-2）FusOn-H2，通过巧妙的双重改造策略，成功构建了名为FusOn-SD的系统性递送增强型溶瘤病毒。该研究旨在评估FusOn-SD在克服免疫清除和抗体中和方面的能力，并检验其全身给药后的抗肿瘤效果。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先是基因工程改造，将人CD47分子的胞外区（Extracellular Domain, ECD）与病毒糖蛋白C（glycoprotein C, gC）融合表达，使病毒颗粒表面展示“别吃我”信号；其次是体外适应性进化筛选，将病毒在含有高滴度抗HSV-2中和抗体的多种属（大鼠、小鼠、人）血清混合物中进行连续传代，以筛选出能抵抗抗体中和的病毒变种；再次是利用免疫缺陷小鼠和免疫健全小鼠构建的皮下移植瘤模型（包括人源肿瘤细胞系HCT116、MPanc-96以及鼠源肿瘤细胞系CT26、LL/2），并通过尾静脉注射进行全身性给药研究；此外，研究还结合了活体生物发光成像（IVIS）技术来实时追踪病毒在体内的分布与持久性，并采用全基因组测序（包括Illumina和牛津纳米孔测序技术）对病毒基因组的稳定性进行了分析；最后，通过蛋白质印迹（Western Blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术分析了病毒颗粒中关键糖蛋白（如gE）的表达情况。
研究结果
基因工程改造使病毒获得免疫逃逸能力
研究人员首先将CD47的胞外区与病毒糖蛋白gC融合，构建了FusOn-CD47-luc。在预先用HSV-2免疫、建立抗病毒免疫的小鼠模型中，静脉注射后，原始的FusOn-luc病毒几乎无法感染肿瘤。而FusOn-CD47-luc则在注射后24小时主要聚集于肝脏，随后（第2天）信号转移至肿瘤部位并持续存在。这表明CD47的展示有效帮助病毒逃避了巨噬细胞的吞噬清除。令人意外的是，FusOn-CD47-luc还表现出对中和抗体的一定抵抗能力，暗示CD47可能通过其他机制影响了体液免疫应答。
连续传代筛选显著增强病毒抗体抵抗性
为了进一步提升病毒对抗体的抵抗能力，研究人员对FusOn-CD47-luc进行了长达49轮的体外传代筛选，依次使用大鼠、人以及混合血清进行压力筛选。经过筛选得到的病毒种群（如FusOn-P9, FusOn-P24）在体外中和实验中形成的噬斑数量显著多于亲本病毒。最终从HR49种群中分离出的一个克隆（命名为FusOn-SD）即使在含有高滴度人源中和抗体的严苛条件下，仍能保持感染性。体内实验进一步证实，在过继转移了人抗HSV-2血清的免疫缺陷小鼠中，FusOn-SD仍能有效抵达并感染人胰腺癌MPanc-96移植瘤。
FusOn-SD在体内展现出优越的治疗效果
在治疗效果评估中，研究人员在两种场景下测试了FusOn-SD。在免疫缺陷小鼠的人结肠癌HCT116模型中，即使存在过继转移的中和抗体，全身给予FusOn-SD仍能显著抑制肿瘤生长，效果明显优于未经改造的FusOn-H2。在免疫健全小鼠的CT26结肠癌模型中，即使采用瘤内注射（以确保病毒剂量一致），FusOn-SD的抑瘤效果也显著强于FusOn-H2和FusOn-CD47-luc，提示其改造带来的优势不仅限于全身递送，还可能增强了病毒在肿瘤组织内的持久性或扩散能力。在另一个对溶瘤病毒治疗相对不敏感的小鼠LL/2肺癌模型中，全身给予FusOn-SD联合环磷酰胺（Cyclophosphamide, CP）和抗PD-1（Programmed cell death protein 1）抗体，产生了最强的协同抗肿瘤效应，而FusOn-H2在相同组合下效果有限，凸显了FusOn-SD改造的必要性。
病毒基因组稳定但关键糖蛋白gE缺失
令人惊讶的是，尽管经历了强烈的选择压力，对FusOn-SD进行的全基因组测序（包括Illumina和牛津纳米孔测序）均未发现其与亲本病毒FusOn-CD47-luc之间存在显著的基因突变。然而，进一步的蛋白质水平分析揭示了一个关键现象：FusOn-SD的病毒颗粒中完全检测不到糖蛋白E（glycoprotein E, gE）的存在，而gE在野生型HSV中与gI形成Fc受体（Fc receptor, FcR）复合物，通常被认为有助于病毒逃避抗体介导的免疫。这一发现与传统认知相悖，其具体机制尚不清楚，可能是导致FusOn-SD抗体抵抗性增强的一个重要因素。尽管gE缺失，FusOn-SD在细胞培养中的复制能力和噬斑形态并未受到明显影响，这可能与其父本病毒FusOn-H2本身具有合胞体（Syncytial, Syn）形态有关，通过细胞融合进行扩散可能补偿了gE缺失对细胞间传播的影响。
讨论与结论
本研究成功开发了一种新型的系统性递送溶瘤病毒FusOn-SD。它通过整合CD47介导的先天免疫逃逸和经过体外筛选获得的适应性免疫（中和抗体）抵抗能力，有效克服了溶瘤病毒全身给药的主要障碍。临床前研究证实，FusOn-SD能够通过静脉注射有效抵达远处肿瘤部位，并在存在抗病毒免疫的情况下发挥显著的抗肿瘤作用。
该研究的创新之处在于其双管齐下的工程策略，以及意外发现的gE蛋白缺失现象。虽然gE缺失的具体原因及其在抗体逃逸中的确切作用仍需深入探讨（可能涉及糖基化修饰改变或其他未知的转录后调控机制），但FusOn-SD在动物模型中表现出的高效性和安全性为其进一步的临床转化奠定了坚实基础。这项研究标志着溶瘤病毒治疗向攻克转移性癌症的目标迈出了重要一步，为开发下一代可用于全身给药的溶瘤病毒平台提供了新的思路和有力的候选者。未来，研究人员将致力于阐明FusOn-SD免疫逃逸的详细分子机制，并探索其与各种免疫疗法联合应用的潜力。
