《Applied and Environmental Microbiology》：An increase in environmental temperature within the growth range suppresses phage resistance in Escherichia coli
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本研究揭示了环境温度在调控大肠杆菌（Escherichia coli）噬菌体抗性中的关键作用。通过详细表征噬菌体S127抗性菌株的表型，发现其因脂多糖（LPS）链截短导致外膜通透性增加、细胞表面疏水性升高，并表现出对疏水性抗菌剂（如单辛酸甘油酯，monocaprin）和高温（46°C）的高度敏感性。研究进一步证明，提高培养温度可诱导抗性菌株的刚果红（CR）结合和自聚集现象，并显著延迟噬菌体处理后的细菌再生。这些发现为在不使用抗生素的前提下，通过温和热处理联合噬菌体应用控制食源性病原体（如肠出血性大肠杆菌EHEC）的抗性种群提供了新策略。
ABSTRACT
为开发不依赖抗生素的噬菌体抗性菌控制策略，本研究对噬菌体S127抗性大肠杆菌BW25113进行了详细表型分析。通过测试参与脂多糖（LPS）合成的基因缺失突变体，发现LPS外核的第一个葡萄糖残基是噬菌体S127感染所必需的。从暴露于S127后存活的细菌中分离出四株抗性菌，其LPS分子量均小于亲本株。膜通透性分析显示抗性菌外膜完整性受损，对单辛酸甘油酯的敏感性增强。此外，在37°C培养时，抗性菌表现出刚果红结合和自聚集现象，而亲本株无此特性。活力测定表明，抗性菌及深粗糙突变体（如ΔhldE、ΔwaaG）在46°C下无法生长。值得注意的是，在46°C预培养的亲本株经噬菌体S127处理后，抗性菌群的再生显著延迟。研究表明，因LPS链截短而获得噬菌体抗性的菌群对疏水性抗菌物质和高温高度敏感，这为控制噬菌体抗性菌提供了关键因素。
INTRODUCTION
抗菌剂的广泛使用导致抗菌素耐药性（AMR）成为全球公共卫生和食品安全的重要问题。噬菌体作为抗菌剂的替代策略，具有特异性强、不促进AMR传播等优势，但在农业和食品生产环境中应用时，常面临噬菌体抗性菌的挑战。为有效控制抗性菌群，需深入了解其独特表型。目前基于噬菌体抗性菌特性且不使用抗生素的控制方法研究较少。本研究以大肠杆菌和裂解性噬菌体S127为模型，旨在通过表征抗性菌表型，为开发新型控制策略提供科学依据。
RESULTS
LPS外核第一个葡萄糖残基是噬菌体高效感染的关键
通过评估噬菌体S127在LPS合成相关基因缺失突变体上的效率（EOP），发现缺失hldE、waaC、waaF、waaG等基因完全阻断了S127感染，而缺失waaO影响较小，表明LPS外核的第一个葡萄糖残基是S127感染所必需的。LPS内核庚糖的磷酸化修饰（如waaP、waaY缺失）也显著降低EOP，提示LPS内外核交界区及庚糖磷酸化对维持噬菌体感染所需的表面结构至关重要。
噬菌体抗性菌株的表征
从S127处理后的存活菌中分离出四株抗性菌（R1–R4），其LPS分子量均小于亲本株，其中R1、R2、R4的LPS与ΔhldE相似，R3与ΔwaaG相似。荧光显微镜和活力测定显示抗性菌外膜通透性增加，形成细胞聚集体，且对单辛酸甘油酯的敏感性升高（R2和ΔhldE的MIC降至250 μM，R3和ΔwaaG降至1,000 μM）。
培养温度对卷曲菌毛生产和自聚集的影响
在37°C或42°C下，抗性菌及ΔhldE、ΔwaaG的刚果红结合增强，而亲本株在30°C下结合最强。自聚集实验显示，37°C培养的R2和ΔhldE在PBS中浊度迅速下降，且该现象依赖于盐浓度（加入0.2 M硫酸铵后ΔwaaG也出现聚集）。疏水性测定表明，R2和ΔhldE在37°C和30°C下均具有更高细胞表面疏水性。
培养温度对抗性菌及突变体生长的影响
所有菌株在44°C下均可生长，但R2和ΔhldE在46°C下无法形成菌落。时间杀灭实验显示，46°C培养24小时后，R1、R2、R4和ΔhldE的活菌数降至检测限以下，而R3和ΔwaaG仍维持104CFU/mL。噬菌体处理实验表明，在46°C下处理亲本株或EHEC菌株No.127可完全抑制抗性菌再生。此外，46°C预培养的亲本株在37°C下经噬菌体处理后，再生延迟且活菌数降低105倍。
DISCUSSION
本研究证实噬菌体抗性菌因LPS截短导致外膜稳定性下降，进而表现出温度敏感性和对疏水性物质的敏感性升高。自聚集和CR结合的温度依赖性可能与σE和σS调控的应激响应有关。抗性菌的热敏感性为联合温和热处理与噬菌体应用提供了理论基础，有望在食品加工和临床环境中控制抗性菌群。
MATERIALS AND METHODS
实验使用大肠杆菌BW25113及其Keio库突变体，噬菌体S127分离自鸡肝。通过EOP测试、LPS银染、膜通透性分析、MIC测定、BATH assay、CR结合及自聚集实验等方法表征菌株特性。热处理和噬菌体处理在指定温度下进行，数据使用Statcel4进行统计分析。
