《Applied and Environmental Microbiology》：Contrasting effects of glutamate and branched-chain amino acid metabolism on acid tolerance in a Castellaniella isolate from acidic groundwater
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本研究揭示了从酸性地下水中分离的 Castellaniella 菌株 MT123 在应对酸性胁迫时，谷氨酸（Glu）代谢与支链氨基酸（BCAA）代谢所扮演的截然相反的角色。通过基因组学、蛋白质组学、代谢组学及RB-TnSeq（基于条形码转座子测序的批量竞争适应性测定）等多组学技术，发现MT123虽缺乏经典的谷氨酸脱羧酶（GadA/GadB）-谷氨酸/γ-氨基丁酸（GABA）逆向转运蛋白（GadC）酸耐受系统，但其通过上调谷氨酸合成酶（GltB/GltD）等途径促进谷氨酸积累，并可能通过未知脱羧酶将谷氨酸转化为GABA以消耗胞内质子（H+），从而增强酸耐受性。相反，BCAA（亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、缬氨酸Val）的胞内积累会抑制其在酸性条件下的生长，可能通过亮氨酸响应调节蛋白（Lrp）介导的反馈调节影响谷氨酸池。该研究为理解环境细菌在酸性胁迫下的适应机制及其在硝酸盐（NO3-）污染地下水生物修复中的应用提供了新见解。
MT123在微酸性条件下生长更佳
地下水酸化和硝酸盐（NO3-）污染是全球性的环境健康危害。反硝化细菌可用于地下水中硝酸盐的原位去除，但共存的胁迫因素（如低pH）会降低生物去除过程的效率。Castellaniella sp. str. MT123是一株从受硝酸盐污染的酸性地下水中分离得到的完全反硝化菌。该菌株在pH < 6.0时能通过硝酸盐呼吸稳健生长，并将硝酸盐完全还原为氮气（N2）。研究比较了MT123在好氧和反硝化条件下于中性（pH 7.5）和微酸性（pH 5.5）环境中的生长情况。结果表明，在好氧条件下，MT123在pH 5.5时的最大生长速率和最终菌量均略高于pH 7.5。在反硝化条件下，尽管酸性环境下亚硝酸盐（NO2-）会以游离亚硝酸（FNA）形式存在并对细胞产生抑制，MT123在pH 5.5时仍能保持稳健生长。
MT123基因组分析揭示其缺乏经典酸耐受系统
在许多细菌中，微酸性或中等酸性条件下的酸耐受性依赖于氨基酸脱羧酶（如谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶）及其相应的逆向转运蛋白系统，通过净消耗胞质质子来实现。对MT123基因组的分析发现，该菌株缺乏经典的谷氨酸依赖系统（GadA/GadB/GadC），并且其他三种氨基酸依赖系统也存在部分缺失。例如，其编码一个推测的精氨酸/赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶，但缺乏相应的逆向转运蛋白基因（如AdiC, CadB, PotE）。此外，MT123基因组中也未发现脲酶系统（ureIABEFG operon）的编码基因，该系统可在极低pH下通过产氨来维持pH稳态。MT123基因组中存在的与酸耐受反应相关的蛋白包括RecA（DNA损伤修复）、DnaK（伴侣蛋白Hsp70）、DnaJ（伴侣蛋白Hsp40）、ClpXP/ClpAP（蛋白酶）、GroEL/GroES（伴侣蛋白Hsp60/Hsp10）和UvrABC（切除核酸酶）等，但这些蛋白在pH 5.5条件下的丰度并未发生显著变化。
pH 5.5生长条件下的蛋白质组变化
研究人员比较了MT123在pH 5.5与pH 7.5条件下（好氧和反硝化）的蛋白质组差异。在好氧条件下，共检测到310个蛋白质丰度发生显著变化（调整后P值 < 0.05），而在反硝化条件下仅有43个。值得注意的是，谷氨酸代谢和BCAA代谢相关蛋白在两种生长条件下均发生显著变化。蛋白质组数据显示，在pH 5.5时，促进谷氨酸合成的酶（如谷氨酸合成酶大亚基GltB和小亚基GltD）丰度增加，而消耗谷氨酸的酶（如谷氨酸脱氢酶GdhA）丰度降低。相反，多个支链氨基酸（BCAA）转运蛋白（如Liv系统的结合蛋白和ATP结合蛋白LivF）的丰度在pH 5.5时显著下降，尤其在好氧条件下更为明显。
蛋白质组和代谢组分析提示谷氨酸生产是酸耐受机制之一
代谢组学分析显示，在pH 5.5条件下，尽管合成途径增强，胞内谷氨酸含量相对于pH 7.5却有所下降，表明细胞在酸性条件下对谷氨酸的需求和消耗增加。同时，胞内GABA含量在pH 5.5时显著升高，提示MT123可能通过一个未知的谷氨酸脱羧酶将谷氨酸转化为GABA，并消耗一个质子（H+）。虽然MT123缺乏GadC逆向转运蛋白，但GABA可能通过GABA分流途径（涉及GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶GabD）回收为琥珀酸，并最终再生为2-氧代戊二酸（2-oxoglutarate），从而形成一个循环。外源添加1 mM谷氨酸能够挽救MT123在更低pH（如pH 4.5和5.0）下的生长缺陷，而添加谷氨酰胺的效果则不明显，进一步证实了谷氨酸本身在酸耐受中的关键作用。
BCAA积累导致pH 5.5生长时BCAA转运受抑制
代谢组学数据显示，在pH 5.5条件下，胞内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的含量均有所增加。与此一致，多个BCAA转运蛋白的丰度在蛋白质组水平上下调。RB-TnSeq突变体适应性分析显示，一些BCAA转运相关基因（如GFF1966, GFF1969, GFF1970）的突变在pH 5.5下表现出正适应性变化（Δfitness > 1），意味着这些基因的功能缺失反而对酸性生长有益。此外，一些BCAA生物合成基因（如ilvI, leuA, leuC, leuD）的突变也显示出正适应性变化。外源添加1 mM的异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，特别是在反硝化条件下，会抑制MT123在pH 5.0的生长，而添加苏氨酸则无此效应。这表明BCAA的胞内积累对酸性条件下的生长有害。这种抑制作用可能通过全局调控因子Lrp介导，因为BCAA（尤其是亮氨酸）是Lrp的效应物，Lrp可调控包括BCAA转运、生物合成以及谷氨酸合成酶（glt）基因在内的多个靶点。
谷氨酸和BCAA对微酸胁迫下MT123适应性的相反效应总结
蛋白质组、代谢组和RB-TnSeq数据共同揭示了谷氨酸和BCAA代谢在MT123应对酸性胁迫中的拮抗作用。在pH 5.5时，细胞通过上调谷氨酸合成、下调其消耗来应对酸胁迫，谷氨酸的积累（及其可能的脱羧作用）对适应性至关重要。相反，BCAA的胞内积累则不利于生长，细胞通过下调BCAA转运和部分生物合成基因的表达来缓解这种负面影响。这两种代谢途径可能通过竞争谷氨酸池或通过Lrp调控网络相互关联。研究还观察到，在反硝化条件下，蛋白质组对酸胁迫的响应远弱于好氧条件，这可能与反硝化过程中产生的游离亚硝酸（FNA）抑制ATP依赖的蛋白质合成与周转有关。
讨论
本研究阐明了MT123一种不依赖于经典Gad系统的谷氨酸依赖性酸耐受机制。其通过促进谷氨酸合成并可能通过未知脱羧酶将其转化为GABA来消耗质子，GABA则可经GABA分流回收。另一方面，BCAA的积累表现出抑制效应，其机制复杂，可能与Lrp调控及对谷氨酸池的间接影响有关。该研究整合多组学与高通量表型分析，揭示了环境细菌Castellaniella应对酸性胁迫的新颖机制，对于理解其在硝酸盐污染酸性地下水生物修复过程中的生态竞争优势具有重要意义。
