急性低剂量苯并[a]芘暴露会导致cyp1a基因表达水平较低的斑马鱼出现神经退行性综合征：这是一种用于检测类似二噁英的环境污染物的新型活体生物指示剂

《Aquatic Toxicology》：Acute low-dose benzo[a]pyrene exposure induces neurodegenerative syndrome in cyp1a low-expression zebrafish: A novel living Bioindicator for dioxin-like environmental pollutants

苯并[a]芘低剂量暴露下cyp1a低表达斑马鱼模型呈现显著毒性增强，包括神经退行性病变、胆碱水平下降及氧化应激，行为学分析显示焦虑样行为和视觉损伤，转录组与KEGG分析揭示神经退行性疾病相关通路富集，证实该模型对极低浓度二噁英类污染物敏感，为环境监测提供新型生物传感器工具。

　　

李敏|黄晓萍|王东杰|陈振翰|王淑兰|钱娴|谢少林

华南农业大学，海洋科学学院，广州510642，中国

摘要

苯并[a]芘（BaP）是一种普遍存在的环境多环芳烃（PAH），其毒性与其关键代谢酶CYP1A的活性密切相关。在这项研究中，我们使用了一种cyp1a表达较低的斑马鱼品系KI（cyp1a^+/+-T2A-mCherry），来探讨在cyp1a缺乏条件下低剂量BaP暴露的毒性效应和机制。结果表明，cyp1a表达降低显著加剧了BaP引起的死亡率、生长抑制、细胞凋亡和氧化应激。此外，还观察到了神经退行性病变以及乙酰胆碱（ACh）水平的下降。行为评估显示，cyp1a表达较低的斑马鱼在暴露后表现出类似焦虑的行为、运动活动改变和视觉障碍——这些效应可能与视蛋白基因（如opn1sw1、opn1sw2）的下调有关。转录组分析进一步揭示了BaP处理后cyp1a表达较低与野生型斑马鱼之间存在显著的基因表达差异。KEGG通路分析显示，cyp1a表达较低组中与神经退行性疾病、细胞周期停滞和细胞凋亡相关的通路富集，同时神经退行性相关基因（如APPa、APPb、PSEN2和TUBB）的表达也发生异常。值得注意的是，这是首次报道cyp1a表达降低会导致对痕量二噁英类污染物（10?13 M TCDD）的行为敏感性增强。当暴露于多氯二苯并-p-二噁英/呋喃（PCDD/Fs）时，该模型表现出明显且可量化的运动行为变化，这突显了其作为环境监测高度敏感新型生物传感器的潜力。总体而言，本研究不仅证实了cyp1a缺乏会显著增加斑马鱼对BaP诱导的神经退行性的敏感性，还确立了cyp1a表达降低模型作为评估二噁英类污染物风险和早期预警的新型生物标志物的价值，显著提升了环境毒理学研究的灵敏度和特异性。

引言

多环芳烃（PAHs）和二噁英类化合物（DLCs）是两类典型的持久性有机污染物（POPs），具有高毒性、生物累积能力和长距离传输能力（Mandal, 2005; Soursou et al., 2023）。DLCs包括多氯二苯并-p-二噁英/呋喃（PCDD/Fs）和多氯联苯（PCBs），其中2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英（TCDD）的毒性最强且具有高度致癌性（Wang et al., 2010）。PAHs是由两个或多个苯环融合而成的有机化合物，苯并[a]芘（BaP）是其代表性例子。BaP主要来源于化石燃料的不完全燃烧、工业排放和有机物的热解过程，广泛存在于环境空气、香烟烟雾和烤制食品中。由于其亲脂性和化学稳定性，BaP可以通过食物链累积并最终进入人体，对人类健康构成威胁（Wang et al., 2010）。这些持久性污染物由于其强烈的致癌性和致畸性而成为全球环境问题（Liu et al., 2020）。

除了众所周知的致癌性外，研究表明，生命早期接触BaP会干扰神经发育过程，例如影响神经突起的形成和神经元分化（Edwards et al., 2010; Patel et al., 2016）。此外，职业暴露于BaP会损害焦炉工人的认知功能，并降低单胺、氨基酸和胆碱类神经递质的水平（Niu et al., 2010）。长期暴露于低剂量BaP甚至会在斑马鱼中诱发类似神经退行性疾病的综合征（Gao et al., 2015）。

斑马鱼拥有五个CYP1基因：CYP1A、CYP1B1、CYP1C1、CYP1C2和CYP1D1（Stegeman et al., 2015）。根据我们之前的研究（Xie et al., 2018; Xie et al., 2023），KI斑马鱼对BaP的敏感性增强主要是由于cyp1a表达显著降低导致的直接解毒功能缺陷。细胞色素P450 1A（CYP1A）基因编码了对多环芳烃（PAHs）等环境污染物生物反应中的关键酶之一。CYP1A的作用具有双重性：一方面，它代谢激活PAHs，产生毒性更高的中间产物，进而引发氧化应激和DNA损伤（Incardona et al., 2004, 2006, 2011）；另一方面，CYP1A可以将BaP代谢为更易溶于水的产物，促进其排泄从而减轻毒性（Shankar et al., 2019; Brown et al., 2015）。由于cyp1a表达水平与PAH暴露之间存在强烈的剂量-反应关系，该基因被广泛用作环境污染监测的敏感生物标志物（Geier et al., 2018）。

基于此，我们的研究团队利用CRISPR/Cas9基因敲入技术构建了一种斑马鱼品系，其中内源性cyp1a启动子驱动红色荧光蛋白的表达。该品系被命名为KI（cyp1a^+/+-T2A-mCherry）斑马鱼（KI）。观察到cyp1a基因的荧光标记导致其表达显著下调，使得KI斑马鱼对BaP的敏感性增加，在短期暴露后死亡率也更高（Xie et al., 2018）。此外，在暴露实验中，即使在非致死低浓度下，KI斑马鱼与野生型斑马鱼之间也出现了显著的行为差异。

本研究旨在全面评估cyp1a表达较低斑马鱼模型中低剂量BaP暴露的毒性后果及其潜在机制，并评估其作为二噁英类污染物新型生物传感器的潜力。具体目标包括：（1）确定该敏感模型中BaP的发育毒性和急性致死剂量（LC₅₀）；（2）表征BaP引起的组织（肝脏、肠道和大脑）的病理损伤、细胞凋亡和氧化应激；（3）评估神经行为改变及相关的神经递质（ACh）变化；（4）进行转录组分析以识别差异表达基因和失调的通路，特别是与神经退行性相关的通路；（5）测试该模型对超痕量二噁英类污染物（TCDD和PCDD/Fs）的行为敏感性，以验证其作为环境监测的放大型表型生物传感器的有效性。通过整合表型、分子和行为终点，本研究旨在确立cyp1a表达较低斑马鱼作为生态风险评估和持久性有机污染物早期预警的变革性工具。

实验鱼类和化学物质

本研究使用了野生型AB品系斑马鱼（WT）和cyp1a表达较低的转基因品系（cyp1a^+/+-T2A-mCherry）（KI）。WT来自中国斑马鱼资源中心（武汉），而KI则是在我们实验室建立的（Xie et al., 2023）。健康的成年斑马鱼在标准条件（28 ± 1 °C，14/10小时光照/黑暗周期）下的循环系统中饲养。胚胎来自自然产卵，并在E3培养基中培育。

LC₅₀值和发育指数

在暴露于50 μg/L BaP 24小时后，所有KI斑马鱼全部死亡，而WT斑马鱼在整个实验过程中均未出现显著死亡（图1a–d）。高浓度BaP对KI斑马鱼的致死效应随时间增加。KI斑马鱼的死亡率显著高于WT斑马鱼（p < 0.05）。浓度-死亡率曲线的比较表明，KI幼鱼的死亡率随时间增加

讨论

苯并[a]芘（BaP）是一种在环境中普遍存在的多环芳烃（PAH）。作为细胞色素P450家族的关键成员，CYP1A在外源性有毒物质的代谢中起着关键作用。现有文献表明，CYP1A在生物体内多环芳烃的代谢中具有双重作用（Incardona et al., 2004, 2006, 2011; Shankar et al., 2019; Brown et al., 2015）。我们的先前研究结果也支持了这一点（

结论

总之，cyp1a基因的缺乏显著加剧了斑马鱼对BaP诱导的发育毒性、细胞凋亡毒性和氧化应激。此外，cyp1a缺乏还显著增强了BaP引起的神经毒性，导致神经退行性病变、行为异常和氧化应激，以及与神经退行性相关的基因（APPa、APPb、PSEN2和TUBB）的表达失调。转录组分析进一步证实了这一点

CRediT作者贡献声明

李敏：撰写——初稿、方法论、概念构建。黄晓萍：撰写——初稿、方法论、概念构建。王东杰：撰写——审稿与编辑、数据管理。陈振翰：数据管理。王淑兰：数据管理。钱娴：验证。谢少林：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构建。