《Applied and Environmental Microbiology》：Functional characterization of a novel p-coumarate 3-hydroxylase from Trametes versicolor
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本刊编辑推荐：本研究首次在真核生物中发现并表征了来自白腐真菌黄硬孔菌（Trametes versicolor）的A类黄素蛋白单加氧酶（FPMO）——TvMNX3和TvMNX4，证实其具有对香豆酸（p-CA）3-羟化酶活性，可将p-CA转化为咖啡酸（CFA）。该发现不仅揭示了真菌降解木质素衍生羟基苯基单元（H-unit）化合物的新途径，拓展了对真菌芳香族分解代谢的认知，而且由于TvMNX4能高效催化生成具有生物活性的酚类（如CFA和白皮杉醇），其在可持续合成药物及聚合物前体等生物技术领域展现出巨大应用潜力。
真菌代谢p-CA的途径分析
研究首先评估了黄硬孔菌（Trametes versicolor）对p-香豆酸（p-CA）的代谢能力。培养实验显示，在8天内，培养基中p-CA的浓度从初始的2.0 mM显著下降至0.15 mM。通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，鉴定出多种单羟基化和双羟基化代谢产物。单羟基化产物包括4-羟基苯甲酸（4-HBA）、4-羟基苯甲醛（4-HBALD）和4-羟基苄醇（4-HBALC）；双羟基化产物则包括咖啡酸（CFA）、原儿茶酸（PCA）、氢醌（HQ）和1,2,4-三羟基苯（THB）。这些结果表明，黄硬孔菌通过两条主要途径代谢p-CA：一条是辅酶A（CoA）依赖的β-氧化样途径，生成4-HBALD和/或4-HBA；另一条是邻位羟基化途径，直接生成CFA。进一步追踪CFA的代谢发现，其浓度在8天内从2.0 mM降至0.03 mM，并检测到PCA、3,4-二羟基苯甲醛（DHBALD）和THB等代谢物，表明CFA可被真菌进一步降解。
寻找黄硬孔菌基因组中的p-CA 3-羟化酶
黄硬孔菌基因组编码41个FPMO基因，其中29个属于A类，12个属于B类。研究基于系统发育分析，从不同的进化枝中选择了7个候选FPMO基因（包括已知的TvMNX1和TvMNX3）进行异源表达和功能筛选。这些候选酶在Escherichia coli中成功表达并纯化，SDS-PAGE和紫外-可见吸收光谱分析证实获得了具有完整黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子的纯化重组蛋白。
对p-CA衍生物的催化转化能力
酶活分析显示，在7个候选FPMO中，仅有TvMNX3和TvMNX4（原编号Tv47635）能够以NADPH为辅因子，催化p-CA羟基化生成CFA。TvMNX3仅能利用NADPH，而TvMNX4既能利用NADPH也能利用NADH，且对NADPH的催化效率更高。这是首次在真核生物的A类FPMO超家族成员中发现p-CA 3-羟化酶活性。此外，TvMNX4还能羟基化HQ和4-HBA。底物谱分析表明，TvMNX3和TvMNX4分别能催化6种和10种p-CA衍生物及其代谢中间体的羟基化反应，包括酚（PH）、4-HBALD、4-HBALC、甲氧基氢醌（MHQ）、2,6-二甲氧基氢醌（DMHQ）、阿魏酸（FA）以及二酚类化合物白藜芦醇（RES）等。TvMNX3和TvMNX4的最适反应条件均为40°C和pH 7.0。
羟基化效率与动力学参数比较
羟基化效率（羟化产物生成量与NADPH消耗量的比值）是衡量A类FPMO催化性能的关键指标。TvMNX3对HQ的羟基化效率最高（90%），其次为4-HBA（67%），对p-CA的羟基化效率相对较低（22%）。相比之下，TvMNX4对p-CA和4-HBA均表现出极高的羟基化效率（分别为94%和92%），而对其他芳香族化合物的效率则为中等水平。动力学参数分析显示，TvMNX3对HQ的催化效率（kcat/Km）最高，而TvMNX4对p-CA和4-HBA的催化效率最高且相当。这些数据表明，TvMNX4是黄硬孔菌中催化p-CA和4-HBA羟基化的主要酶。
预测结构的比较分析
为了解TvMNX3和TvMNX4底物特异性的结构基础，研究表达了与其同属一个A类FPMO进化枝的典型酶——来自Trichosporon cutaneum的酚羟化酶（PHHY）和来自Aspergillus nidulans的4-羟基苯甲酸3-羟化酶同源物（AnPhhA）。酶活测试证实PHHY不能羟基化p-CA，而AnPhhA可以。通过AlphaFold2预测了TvMNX3、TvMNX4和AnPhhA的三维结构，并与PHHY的晶体结构进行比较。结构比对和分子对接模拟显示，TvMNX3、TvMNX4和AnPhhA的底物结合口袋上缘空腔明显大于PHHY，这使其能够容纳侧链较长的p-CA。特别是TvMNX4的空腔最为宽敞，这可能解释了其能催化更大底物（如RES）的原因。关键残基分析表明，TvMNX4中的Leu219是维持其对大底物催化活性的关键。将TvMNX4的Leu219突变为精氨酸（L219R）后，该变体对p-CA的羟基化效率和催化效率急剧下降，且对MHQ、DMHQ、FA和RES失活，证实了该残基的重要性。
TvMNX3和TvMNX4的转录调控
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析显示，当培养基中添加4-HBA或p-CA时，TvMNX3和TvMNX4的基因转录水平均被显著上调，表明这两种酶的表达受芳香族化合物的诱导，很可能在黄硬孔菌体内参与4-HBA和p-CA的转化过程。
讨论与意义
本研究阐明了黄硬孔菌通过A类FPMOs——TvMNX3和TvMNX4——羟基化p-CA的酶学基础。这是首次在真核真菌中发现并表征具有p-CA 3-羟化酶活性的A类FPMOs。与已知的植物细胞色素P450型和细菌D类FPMO型p-CA 3-羟化酶不同，该发现揭示了此催化功能在不同物种间进化上的多样性。TvMNX4因其高效的催化性能、广泛的底物谱以及生成高价值生物活性酚类化合物（如CFA和白皮杉醇）的能力，在绿色生物制造和可持续合成领域具有重要的应用前景。结构分析表明，底物结合口袋上缘的空间构型是决定这些FPMOs底物特异性的关键因素。未来的研究需要通过基因敲除或过表达等遗传学手段，在体内进一步验证TvMNX3和TvMNX4在黄硬孔菌p-CA分解代谢中的生理功能。
