优化烷烃羟化酶的生产和纯化操作条件，用于石油废弃物的生物修复

《Biomass and Bioenergy》：Optimization of operational conditions for the production and purification of the alkane hydroxylase enzyme for Bioremediation of Petroleum Waste

石油烃水解酶的生产与纯化优化研究。采用响应面法结合三因素实验设计，通过Origin 2026和MINITAB 22软件分析温度（30-37℃）、pH（7.0-7.5）、溶氧量（80%）等参数对酶活性的影响，石油底物活性达94.3 U/L，葡萄糖底物5.64 U/L。研究显示预接种量对PD7菌株活性影响显著，但比活性较低，需增加纯化步骤。

　　

Evelin D.S.S. Franco | Danusia F. Lima | Camila P. Dantas | Ricardo de Souza Menezes | Olivia M.C. de Oliveira | Ant?nio FS. Queiroz | ícaro T.A. Moreira

地球化学：巴伊亚联邦大学（UFBA）地球科学研究所POSTPETRO研究生课程中的石油与环境研究 / 地址：Av. Adhemar de Barros, s/n., Ondina, CEP 40170-110, Salvador, Bahia, Brazil

摘要

烷烃羟化酶在石油废水、废弃石油以及低分子量聚乙烯等石油工业废物的回收利用中具有重要作用。然而，为了减少不必要的废物产生并促进产业的可持续发展，优化该酶的生产和纯化过程至关重要。本文主要介绍了与酶生产及纯化优化相关的研究结果。优化工作采用Origin 2026软件中的响应面分析法完成；MINITAB? Release 22软件用于生成三个因子设计并执行响应面分析。在纯化过程中，共实施了三个过滤步骤。研究发现：在35°C和30°C的温度下，烷烃羟化酶在石油和葡萄糖底物上的最佳活性分别为94.3 U/L和5.64 U/L；最佳pH值为7和7.5；最佳氧饱和度为80%。为了避免产生额外废物，第二次实验设计中仅使用了PD7菌株。对于由RA2菌株生产的酶，其活性随温度变化显著，尤其是在30–37°C范围内。尽管优化措施有效提高了酶的纯度，但其比活性仍较低。我们认为增加一个纯化步骤可能有助于解决这一问题。

引言

酶在多种工业过程中具有重要应用，包括有机废物的处理[1]。烷烃羟化酶可用于石油废水、低分子量聚乙烯或残余石油等石油衍生化合物的回收[2][3][4]，从而实现废水的再利用，这符合2030年议程及COP 30会议提出的至少两项目标：“清洁水和卫生”以及“应对全球气候变化”[5][6]。然而，提升酶的生产和纯化效率对于降低生产成本及解决工业应用中的问题至关重要[7]。 酶的产量受操作参数（如pH值、温度、压力、浓度、底物和氧饱和度）以及环境变化和其他化合物的相互作用影响[8][9]。因此，优化操作条件以提升酶的活性至关重要。响应面分析法是一种用于优化工艺并提高产品产量的统计技术，尤其在石油化工废物污染区域的修复应用中效果显著[10][11]。 因子设计有助于确定影响响应程度的关键变量，这两种技术常结合使用于优化研究[12]。 [13]通过Plackett-Burman设计和中心复合设计优化了α-淀粉酶的生产条件，发现pH值为7、生产时间为24小时时α-淀粉酶的活性最高。 在纯化过程中，通常会结合多种提取技术和色谱方法（如亲和色谱、离子交换、尺寸排阻色谱等）[14][15][16]。 在膜过滤过程中，建议先使用微滤膜再使用超滤膜，以去除生物精炼和水处理过程中的微生物干扰[17][18][19]。确定膜的临界通量和最佳通量对于维持其效率至关重要。如果操作不当，可能会导致所需产品无法有效获得。因此，本文旨在优化烷烃羟化酶的生产和纯化条件，以提升其在环境生物修复中的应用潜力[20]。

预培养条件

用于生产烷烃羟化酶的微生物为PD7和RA2菌株，属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.），从红树林沉积物中分离获得[21][22]。这些菌株已获得国家工业产权研究所（INPI）的专利保护（专利编号[23]），并在美国国家生物技术信息中心（NCBI）注册（登录号MW881196和MW881202）。 这些菌株在Luria-Bertani（LB）固体培养基（KASVI）中培养。

数据正态性分析

表7显示，PD7-MW881202菌株的数据为非参数数据；而RA2-MW881196菌株和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的数据呈正态分布（p值大于0.05，见表8和表9）[35]。 接下来对PD7-MW881202数据进行了Kruskal-Wallis检验，并通过Dunn事后检验确认了各因素间的显著差异。 表10表明，各组菌株的平均活性水平无显著差异。

结论

优化酶的生产和纯化条件对于推动其市场应用至关重要，因为纯度直接影响其使用效果。本研究提出了一种有效的优化策略，但仍需进一步改进以提高最终比活性。 实验过程中生成了两种实验设计，其中第一种设计用于筛选关键因素。

CRediT作者贡献声明

Evelin D.S.S. Franco：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、软件应用、资源协调、项目管理、方法设计、实验设计、资金筹集、数据分析、概念构建。 Danusia F. Lima：项目管理、方法设计、实验设计、资金筹集、数据分析、概念构建。 Camila P. Dantas：数据可视化、方法设计、实验设计、资金筹集。 Ricardo de Souza Menezes：

声明

在本文撰写过程中，作者使用了[GRAMMARLY]工具来改进文本的拼写和语法。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

利益声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢Shell Brasil公司在“GEOQPETROL - GEOMICRO”项目（ANP 20720-9）中的支持，以及巴西国家石油公司（ANP）通过研发税收政策提供的战略支持。同时，也感谢LEPETRO公司在石油、能源和环境地球化学领域的卓越贡献。