经过基因工程改造、具有细胞膜伪装特性的纳米颗粒能够增强机体对复发性转移性三阴性乳腺癌的免疫反应

《Biomaterials》：Genetically engineered cellular membrane-camouflaged nanoparticles amplify immune response against recurrent metastatic triple-negative breast cancer

三阴性乳腺癌（TNBC）复发代谢重编程与免疫逃逸协同调控机制及纳米平台构建。本研究开发PD-1变体修饰的细胞膜纳米囊泡负载3-溴丙酮酸的3BP@CP NPs，通过双重靶向抑制HK2诱导代谢崩溃与免疫原性细胞死亡，逆转肿瘤微环境免疫抑制。实验证实该纳米平台可显著抑制转移并延长生存期，建立代谢-免疫协同干预新范式。

　　

云阳|刘青雅|潘萌|李西成|莫东|北中武|李建安|楚炳阳|曲颖|徐学文|钱志勇

四川大学华西医院癌症中心生物治疗科及国家生物治疗重点实验室，整形与烧伤外科研究实验室，成都，610041，中国

摘要

癌症的进展是由代谢重编程和免疫逃逸之间的动态相互作用驱动的。其中心机制是有氧糖酵解，它为肿瘤生长提供能量，同时削弱抗肿瘤免疫。为了应对复发性转移性三阴性乳腺癌（TNBC），我们开发了一种仿生纳米平台（3BP@CP NPs），该平台由高亲和力程序性死亡-1（PD-1）修饰的细胞膜纳米囊泡组成，这些纳米囊泡包裹了含有3-溴吡ruvate（3BP）的纳米颗粒。优化后的纳米颗粒表现出增强的药代动力学和更长的循环时间，能够实现双重靶向PD-L1的肿瘤归巢和检查点抑制。糖酵解抑制剂3BP特异性抑制hexokinase II（HK₂）的活性，触发代谢崩溃和免疫原性细胞死亡，同时逆转肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制。这种协同的代谢-免疫干预措施能够引发强烈的全身性抗肿瘤反应，减少肿瘤复发和转移，并延长侵袭性TNBC模型的生存期。总体而言，本研究建立了一种结合免疫检查点受体修饰的细胞膜纳米囊泡（ICB CVs）与代谢调节剂的治疗方法，以提高复发性转移性TNBC的免疫治疗效果，为PD-L1表达的恶性肿瘤提供了一种具有临床转化潜力的方法。

引言

TNBC是最具侵袭性的乳腺癌亚型，其特征是高转移潜能、频繁复发和不良临床结局[1]、[2]、[3]。由于缺乏雌激素受体（ER）、孕酮受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达，TNBC对内分泌或HER2靶向治疗具有内在抗性，因此细胞毒性化疗成为标准治疗方法，尽管其疗效有限且毒性较大[4]、[5]。最近在肿瘤免疫学方面的进展表明，TNBC具有独特的免疫原性特征，表现为丰富的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和升高的PD-L1表达[6]、[7]、[8]、[9]，这提示其可能对免疫检查点阻断（ICB）敏感[10]、[11]。然而，PD-1/PD-L1抑制剂在晚期TNBC中的临床试验客观反应率低于25%[12]、[13]、[14]、[15]。值得注意的是，关键试验的结果存在差异（例如，IMpassion130试验观察到无进展生存期的改善，而IMpassion131试验失败，两者都针对PD-L1抑制[12]、[15]），这凸显了当前ICB策略的根本局限性，并强调了阐明耐药机制的必要性。

现有的PD-L1靶向免疫疗法面临许多生物学和药理学障碍。除了TNBC本身的异质性（包括低水平或异质性的PD-L1表达）外，主要障碍还包括药物递送不足和高度免疫抑制的TME[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。为了解决这些问题，生物工程平台如ICB CVs应运而生。通过保持天然受体拓扑结构并利用仿生特性，ICB CVs提高了肿瘤靶向性和渗透性，同时最小化了全身毒性[17]、[18]、[22]、[23]、[24]。此外，代谢重编程，特别是Warburg效应，在促进肿瘤进展和免疫逃逸中起着关键作用[25]、[26]。TNBC细胞表现出较高的糖酵解通量，与免疫细胞竞争葡萄糖并积累免疫抑制性的乳酸，这会损害细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能并上调肿瘤细胞上的PD-L1表达[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。值得注意的是，关键的糖酵解酶HK₂在TNBC中过度表达，并与不良预后相关[32]、[33]、[34]。临床前研究表明，抑制HK₂可以逆转免疫抑制并与ICB产生协同作用[35]，为双重代谢-免疫治疗策略提供了有力的依据。

在这项研究中，我们开发了一种针对复发性转移性TNBC的联合治疗策略，同时靶向PD-L1介导的免疫逃逸和肿瘤糖酵解（图1）。我们设计了用高亲和力PD-1变体修饰的细胞膜衍生纳米囊泡（称为hPV CVs），以实现检查点阻断。所得的hPV CVs利用了工程hPV蛋白的固有特性，该蛋白在不同物种中对PD-L1的结合亲和力提高了2,200至40,000倍，从而显著提高了阻断效率[36]。为了解决传统膜囊泡中常见的药物泄漏问题，使用壳聚糖-聚己内酯接枝共聚物（CS-g-PCL）制备了核心纳米颗粒，以实现3BP的稳定封装；这些颗粒被称为3BP NPs[18]、[37]。这些核心纳米颗粒具有高药物装载能力和持续释放特性。将其涂覆hPV CVs后，形成了仿生的3BP@CP NPs，这些纳米颗粒可以逃避免疫清除，延长循环半衰期，并促进肿瘤特异性积累，从而增强PD-L1阻断和肿瘤细胞内化。当细胞摄取这些纳米颗粒后，3BP在细胞内释放，抑制HK₂活性和糖酵解，减少三磷酸腺苷（ATP）和乳酸的产生，最终促进肿瘤细胞凋亡，同时重新激活抗肿瘤免疫反应。这种策略共同对抗PD-L1介导的免疫逃逸，诱导免疫原性肿瘤细胞死亡，并重塑免疫抑制的TME，从而抑制肿瘤进展和转移。我们的研究为复发性转移性TNBC引入了一种合理设计的治疗策略，并建立了一个可用于多种恶性肿瘤的细胞膜囊泡工程化平台，具有广泛的转化潜力。

材料

马来酸酐、ε-己内酯、4-二甲基氨基吡啶（DMAP）、邻苯二甲酸酐和壳聚糖（M_W ≤ 2000）购自上海Macklin生化科技有限公司。Novozyme-435购自Sigma-Aldrich。乳酸测定试剂盒和Cy5.5购自Solarbio科技有限公司。增强型ATP测定试剂盒和CO-IP购自Beyotime生物技术有限公司。Calcein-AM/PI双染色试剂盒和Annexin V-FITC/PI（40302ES50）购自上海

3BP@CP NPs的制备与表征

3BP@CP NPs是通过分层组装过程构建的，其中3BP NPs被封装在hPV CVs内（图1A）。CS-g-PCL共聚物是通过三步保护-接枝-脱保护路线合成的[38]、[39]、[40]：1) 根据先前报道的程序[40]，通过化学选择性N-邻苯二甲酰化壳聚糖来合成N-邻苯二甲酰基保护的壳聚糖（PHCS）；2) 与不同分子量的PCL-COOH链进行酯化（图S1和S2）

结论

复发性转移性TNBC的管理仍然是一个重大的临床挑战，受到其侵袭性表型、靶向疗法的缺乏以及抑制传统免疫疗法效果的免疫抑制性TME的限制。为了解决这些限制，我们开发了3BP@CP NPs，这是一种仿生纳米平台，它将糖酵解抑制剂3BP与显示高亲和力PD-1变体的细胞膜衍生囊泡共同递送。这种设计增强了药代动力学

CRediT作者贡献声明

楚炳阳：正式分析。李建安：研究。徐学文：监督、正式分析、概念化。曲颖：正式分析。云阳：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、方法学、研究、资金获取、数据管理、概念化。钱志勇：可视化、验证、方法学、研究、资金获取、概念化。潘萌：验证、研究。刘青雅：撰写——

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资源可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文或补充信息文件中。

资金来源

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC82202320、NSFC32530059和NSFC31771096）、四川省自然科学基金（2023NSFSC1585）以及四川大学华西医院的博士后研究项目（编号19HXBH099）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：钱志勇报告称获得了国家自然科学基金的支持。云阳报告称获得了国家自然科学基金的支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响研究结果

致谢

作者衷心感谢上海Bioprofile科技有限公司在LC–MS实验中提供的技术支持。作者还感谢四川大学分析测试中心的Shanling Wang在TEM实验中的技术协助。