经硼酸基团修饰的锰卟啉纳米颗粒可逃避巨噬细胞的吞噬，从而通过磁共振成像（MRI）技术用于淋巴结转移的诊断

《Biomaterials》：Boronic Acid Group Modified Mn-Porphyrin Nanoparticles Evade Macrophage Uptake for Lymph Node Metastasis Diagnosis via MRI

本研究通过表面修饰策略开发了新型MRI纳米探针，发现硼酸基团修饰的Mn-卟啉纳米颗粒具有显著巨噬细胞逃逸能力，延长血液循环时间，在淋巴结转移模型中实现优异成像效果，为淋巴结病变诊断提供新方法。

　　

付晓敏|蔡中原|傅胜祥|曹英子|顾浩杰|金荣荣|夏春潮|柳苏|宋斌|龚启勇|郭英坤|艾华

放射科，教育部妇儿出生缺陷及相关疾病重点实验室（四川大学），四川大学华西第二医院，成都610041，中国

摘要

淋巴结转移是癌症预后的关键因素；然而，目前尚无临床批准的造影剂可以通过医学成像准确检测淋巴结转移。巨噬细胞对纳米粒子（NP）在淋巴引流过程中的摄取作用一直存在争议。本文报道了一种新的淋巴结成像策略，通过修改纳米粒子表面来增强其在淋巴结中的滞留时间，同时避免被巨噬细胞清除，从而提高淋巴结转移的诊断准确性。我们设计了一系列基于Pluronic F127的纳米粒子作为磁共振成像（MRI）造影剂，这些纳米粒子含有不同功能基团（-CH₃、-OH、-COOH、-NH₂和-B(OH)₂）。研究了这些表面修饰对纳米粒子物理化学性质和逃避巨噬细胞能力的影响。结果表明，经过硼酸修饰的Mn-卟啉纳米粒子表现出优异的巨噬细胞逃避能力，在体外实验中巨噬细胞摄取显著减少，在体内循环时间延长。在淋巴结转移模型中，通过局部注射（0.005 mmol Mn/kg）给药后，硼酸修饰的Mn-卟啉纳米粒子实现了最佳的淋巴结MRI对比度，并且成像窗口延长。此外，在新西兰兔子实验中，即使使用较低剂量（0.0025 mmol Mn/kg），硼酸修饰的Mn-卟啉纳米粒子也能提供出色的淋巴系统可视化效果，显示出进一步转化研究的潜力。总之，本研究表明了硼酸基团修饰策略的可行性，该策略能够避免巨噬细胞摄取，并利用淋巴引流来诊断淋巴结转移，为开发下一代逃避巨噬细胞的纳米探针提供了宝贵见解。

引言

肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因，其中淋巴转移是大多数实体瘤扩散的主要途径[1]。肿瘤细胞通过淋巴管侵入淋巴系统并扩散到淋巴结，导致淋巴结转移[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。前哨淋巴结（SLN）是首先被肿瘤细胞侵袭的淋巴结，是实体瘤患者预后的关键指标，无论原发肿瘤的大小如何[7]。例如，在乳腺癌中，约10-30%的T1期肿瘤（< 2 cm）和55-70%的较大肿瘤（> 3 cm）会发生腋窝淋巴结转移[8]。因此，准确诊断淋巴结转移对于肿瘤分期和手术计划至关重要。然而，由于目前没有临床批准的造影剂，使用医学成像技术检测淋巴结转移仍然具有挑战性。

磁共振成像（MRI）以其出色的软组织对比度、空间分辨率和深部穿透能力而在淋巴结转移成像中发挥着重要作用。为了提高MRI的诊断能力，两种超顺磁性铁氧化物Ferumoxytol和Ferumoxtran-10已被纳入临床试验，作为淋巴结转移的T2造影剂[9]、[10]、[11]。这些造影剂利用正常淋巴结和转移淋巴结之间巨噬细胞分布的差异，通过巨噬细胞介导的纳米粒子摄取来区分转移淋巴结和良性淋巴结[12]、[13]、[14]、[15]。基于这一原理，已经开发了几种基于纳米粒子的造影剂[16]、[17]、[18]。然而，巨噬细胞分布与淋巴结转移阶段之间的复杂关系仍不清楚，可能导致假阳性或假阴性结果，从而阻碍了这些造影剂的临床应用[19]、[20]。为了解决这些问题，我们提出了一种新的成像策略，通过增强渗透性和滞留效应（EPR）来避免巨噬细胞清除，并提高对转移淋巴结的被动靶向性[21]。具体来说，我们建议通过设计能够避免巨噬细胞摄取的纳米粒子，根据淋巴管通透性的变化和淋巴引流的紊乱来区分正常淋巴结和转移淋巴结。

该策略的关键在于避免巨噬细胞摄取，即通过表面化学修饰（如PEG化、CD47涂层等）来减少纳米粒子被巨噬细胞识别和吞噬，从而避免网状内皮系统（RES）的清除，延长血液循环时间，进而调节其在淋巴系统中的积累[22]、[23]、[24]、[25]。在表面修饰策略中，纳米粒子的表面功能基团是与巨噬细胞的初始接触界面，它们通过调节关键参数（如表面电荷分布、亲水/疏水性质、蛋白质冠层形成模式和细胞膜相互作用）来影响巨噬细胞的识别和摄取行为[26]、[27]。例如，带正电荷的功能基团（如氨基）通常会增强与细胞膜的静电相互作用，从而促进细胞摄取，而中性或战略性设计的极性功能基团则可能通过减少调理素蛋白吸附或模拟细胞膜成分来避免巨噬细胞摄取[28]、[29]、[30]。基于这些原理，研究不同功能基团修饰对纳米粒子逃避巨噬细胞能力的影响可以为设计具有优异巨噬细胞逃避性能的纳米粒子提供重要见解。

为了验证这种方法的有效性，纳米材料应表现出优异的生物相容性、稳定性和表面修饰能力，以调节其与巨噬细胞的相互作用。锰卟啉（Mn-卟啉）分子因其强大的螯合稳定性而成为有前景的候选者，这种稳定性降低了跨金属毒性风险（如纤维化或神经毒性），并确保了优异的生物相容性和安全性[31]、[32]、[33]、[34]。更重要的是，卟啉环的共轭结构有利于亲电取代反应，使得可以引入多种功能基团来调节物理化学性质和调节巨噬细胞相互作用[35]。这些结构特性使卟啉成为研究功能基团-巨噬细胞逃避关系的理想分子支架。此前，我们已成功开发了基于Mn-卟啉的MRI/荧光和PET/MRI多模态造影剂用于淋巴结转移成像[36]、[37]。值得注意的是，我们的研究表明，附着在Mn-卟啉上的功能基团显著影响了巨噬细胞的摄取行为。然而，基于Mn-卟啉的纳米粒子的功能基团与其逃避巨噬细胞能力之间的关系，特别是在淋巴结成像背景下，仍不清楚。

基于这些考虑，本研究选择了五种代表性的功能基团进行探究：甲基基团（-CH₃）代表疏水性中性修饰；羟基基团（-OH）代表通过氢键影响蛋白质相互作用的亲水性中性基团；羧基（-COOH）和氨基（-NH₂）基团代表在生理条件下具有不同电荷状态的阴离子和阳离子功能；硼酸基团（-B(OH)₂）具有独特的路易斯酸性质，能够与生物分子形成动态共价键。这种设计涵盖了多种电荷分布、亲水/疏水性质和分子识别模式，为研究功能基团介导的巨噬细胞逃避提供了重要的研究框架。为了实施这一策略，选择了Mn-四苯基卟啉作为核心平台，因为它合成简单、纯化效率高、产率高，是Mn-卟啉研究中的关键化合物。合成了五种含有这些功能基团的Mn-四苯基卟啉衍生物，并使用FDA批准的药用辅料Pluronic F127作为表面活性剂自组装成纳米粒子。评估了这些功能基团对纳米粒子物理化学性质、MRI弛豫率、体外和体内巨噬细胞逃避能力以及药代动力学特性的影响。此外，使用依赖淋巴引流（而非巨噬细胞摄取）的淋巴结转移模型验证了这种方法的可行性（图1）。值得注意的是，卟啉支架可以通过不同的金属（如⁶⁸Ga用于PET成像或Zn²⁺用于荧光/光声成像）进行功能化，从而扩展了这些系统在多种成像模式中的应用范围。因此，本研究的原理和发现可以应用于其他成像技术，为淋巴结转移成像提供重要指导。

材料

Pluronic F127和MnCl₂·4H₂O购自Sigma-Aldrich。5,10,15,20-四(4-羟基苯基)卟啉（THPP）和5,10,15,20-四(对甲苯基)卟啉（TTPP）购自TCI Development Co., Ltd（上海，中国）。5,10,15,20-四(4-硼基苯基)卟啉（TBPP）购自上海腾谦生物技术有限公司。氢氧化钠、浓盐酸和浓硝酸购自中国国家医药集团 Corporation。

Mn-卟啉纳米粒子的合成与表征

本研究研究了五种具有不同功能基团（-CH₃、-OH、-COOH、-NH₂和-B(OH)₂）的Mn-卟啉（图1）。质谱确认了这五种Mn-卟啉分子的成功合成（图S1）。这些分子随后溶解在DMF中，并在加入F127水溶液后自组装成稳定分散的纳米粒子。Mn-卟啉纳米粒子的关键特性包括它们的流体动力学直径、ζ电位等。

结论

我们设计了五种含有可调功能基团（-CH₃、-OH、-COOH、-NH₂和-B(OH)₂）的Mn-卟啉纳米粒子，以研究一种通过淋巴引流介导的淋巴结成像策略，以最小化巨噬细胞摄取。研究结果表明，功能基团的变化显著影响了这些纳米粒子的物理化学性质、体内生物分布和排泄动力学。特别是，经过硼酸修饰的F127-TBPP(Mn)纳米粒子表现出优异的巨噬细胞逃避能力。

CRediT作者贡献声明

郭英坤：撰写 – 审稿与编辑，监督。艾华：监督。龚启勇：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。蔡中原：撰写 – 审稿与编辑，监督，数据管理，概念构思。付晓敏：撰写 – 初稿撰写，方法学设计，数据分析，概念构思。宋斌：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。柳苏：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。夏春潮：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。曹英子：撰写 – 审稿与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

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利益冲突声明

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致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2023YFB3810004）、国家自然科学基金（52073192、82502325）、国家自然科学基金创新研究群体（81621003）、四川省自然科学基金（编号：2025ZNSFSC1522）、四川大学跨学科创新基金的财政支持。