《Biomaterials》：Functionalized osteogenic extracellular vesicles derived from BMP9-stimulated mesenchymal stem cells (MSCs) effectively induce bone regeneration
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本研究针对大段骨缺损修复的临床难题，创新性地利用BMP9刺激间充质干细胞获得功能化外泌体(B9-EVs)。研究表明B9-EVs不仅具备与传统腺病毒介导BMP9过表达相当的成骨效能，且具有无细胞、低免疫原性的独特优势。通过miRNA-seq和RNA-seq联合分析，揭示了B9-EVs通过调控10个关键miRNAs和11个靶mRNAs的独特网络机制诱导成骨分化。该研究为骨组织工程提供了新型细胞-free治疗策略，具有重要转化价值。
骨骼作为人体运动系统的核心组成部分，不仅承担着支撑和保护内脏器官的重要功能，还是矿物质储存和造血干细胞栖息的微环境。然而临床上约有5-10%的骨折患者由于创伤或骨质疏松等原因导致骨愈合障碍，大段骨缺损的修复更是面临严峻挑战。目前常规的自体骨移植、异体骨移植或人工合成材料植入等治疗手段都存在各自的局限性，难以完全满足临床需求。
在这一背景下，间充质干细胞(MSCs)因其具有多向分化潜能和免疫调节功能，成为组织工程领域的研究热点。但传统的细胞治疗方法存在细胞来源不稳定、移植后肺血管滞留等风险。近年来研究发现，MSCs的 therapeutic 效应主要源于其旁分泌作用，而细胞外囊泡(EVs)作为重要的旁分泌介质，能够携带蛋白质、核酸等生物活性物质，在细胞间通讯中发挥关键作用。与传统细胞治疗相比，EVs具有纳米级尺寸、低免疫原性、易于储存等优势，可避免细胞移植相关的安全性问题。
尽管天然MSCs来源的EVs具有一定的组织修复能力，但其成骨诱导活性有限且缺乏特异性。骨形态发生蛋白9(BMP9)是目前已知成骨活性最强的细胞因子之一。重庆医科大学的研究团队创新性地利用BMP9刺激脂肪来源间充质干细胞(iMAD)，成功制备了功能化的成骨外泌体(B9-EVs)，并系统评价了其成骨活性及作用机制。这项重要研究成果发表在生物材料领域权威期刊《Biomaterials》上。
研究人员采用的主要技术方法包括：通过超速离心法从BMP9刺激的iMADS细胞中分离外泌体，利用纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)进行表征；通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测、阿尔新蓝染色等体外实验评估成骨分化能力；建立裸鼠皮下异位成骨模型和C57BL/6J小鼠临界尺寸颅骨缺损模型进行体内功能验证；采用miRNA-seq和RNA-seq进行高通量测序分析，结合生物信息学方法构建miRNA-mRNA调控网络。
3.1. BMP9刺激的MSCs来源外泌体(B9-EVs)具有典型EVs特征
研究团队通过腺病毒载体在iMAD细胞中过表达BMP9，成功分离获得B9-EVs。表征结果显示B9-EVs粒径主要分布在100-300nm之间，电镜下呈现典型的杯状结构，Western blot检测到ALIX、TSG101、HSP70等外泌体标志蛋白，而核蛋白组蛋白H3为阴性，证实了外泌体的成功提取和特性。
3.2. B9-EVs在体外表现出强大的成骨潜能
荧光显微镜和流式细胞术证实B9-EVs可被iMAD细胞有效摄取。剂量依赖性实验显示，60μg/mL的B9-EVs可诱导与AdR-B9处理组相当的ALP活性。成骨标志基因(Opn、Osx、Ocn、Runx2等)表达显著上调，基质矿化沉积明显，证明B9-EVs具有强大的体外成骨诱导能力。
3.3. B9-EVs在体内有效诱导新生骨形成
在裸鼠皮下异位成骨模型中，Micro-CT显示B9-EVs处理组与AdR-B9组均形成明显的骨组织，而对照MV-EVs组未见骨形成。组织学染色进一步证实了成熟骨和软骨结构的形成。在临界尺寸颅骨缺损模型中，B9-EVs处理组缺损区域可见显著的新骨形成，骨矿物质密度(BMD)、骨体积(BV)等参数明显改善。
3.4. B9-EVs未引起显著免疫反应
免疫原性实验表明，B9-EVs皮下注射后未引起局部炎症细胞浸润，外周血白细胞计数及IgM、IgE、IgG水平无显著变化，脾脏组织结构正常，CD68、CD206、CD19、CD3等免疫细胞标志物表达未见异常，证明B9-EVs具有良好的生物相容性。
3.5. B9-EVs与BMP9通过重叠但不同的下游通路诱导成骨
RNA-seq分析发现，B9-EVs处理组有768个基因表达发生显著变化，KEGG富集分析显示这些基因主要参与PI3K-AKT、钙信号、MAPK和TGF-β等成骨相关通路。与AdR-B9处理组比较，发现两者共同调控356个基因，但B9-EVs特异性调控412个基因，表明二者作用机制存在差异。
3.6. B9-EVs通过独特的miRNAs组调控MSCs成骨
Western blot检测发现B9-EVs中仅含有微量BMP9蛋白，提示其成骨活性可能主要通过非BMP9信号通路实现。miRNA-seq鉴定出81个差异表达的miRNAs，其中64个下调，17个上调。这些miRNAs的靶基因显著富集于PI3K-AKT、MAPK、钙信号和WNT等成骨相关通路。
3.7. 功能化B9-EVs通过完整的miRNA-mRNA调控网络诱导骨再生
通过整合分析，研究团队构建了包含10个关键miRNAs（如miR-200a-3p、miR-205-5p、miR-103-3p等）和11个靶mRNAs（如Htr2a、Efna3、Glis1、Bdnf等）的调控网络。这些分子主要参与RAP1和NOTCH等成骨信号通路，以及细胞分化和血管生成等生物学过程。
研究结论与讨论部分强调，功能化B9-EVs不仅具备与直接BMP9刺激相当的成骨效能，而且避免了病毒基因递送相关的生物安全风险。其成骨机制涉及独特的miRNA-mRNA调控网络，与经典BMP9信号通路既存在重叠又具有明显区别。这种细胞-free的治疗策略为骨组织工程提供了新的思路，特别是利用永生化细胞作为外泌体生产平台，既保证了细胞表型的稳定性，又避免了直接体内应用的风险。
该研究的创新点在于首次系统阐明了BMP9功能化外泌体的成骨效能及机制，突破了传统细胞治疗和基因治疗的局限性。未来研究将聚焦于人源MSCs来源B9-EVs的验证、体内靶向递送策略的优化以及关键miRNAs的功能验证，进一步推动这一细胞-free治疗策略的临床转化。
