《Biomaterials》：A Self-Assembled Protein Nanocage as a Universal Influenza Vaccine Induces Enhanced Broadly Cross-Reactive Immunity
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自组装蛋白质纳米笼（SAPNs）通过优化抗原空间排列，将保守NP肽段嵌入内部并暴露HrHA和4M2e于外部表面，显著增强对流感病毒的多价免疫应答，包括T细胞激活和交叉反应性抗体产生，为开发通用流感疫苗提供新策略。
朴载英（Jaeyoung Park）| 西德尼·C·温伯利（Sydney C. Wimberley）| 托马斯·Pho（Thomas Pho）| 玛丽埃拉·罗德里格斯-奥特罗（Mariela Rodriguez-Otero）| 朱莉·A·钱皮恩（Julie A. Champion）
美国乔治亚理工学院化学与生物分子工程学院，亚特兰大，GA 30332
摘要
蛋白质是疫苗设计的有效平台，它们能够实现多价抗原的呈现，并稳定抗原结构以增强免疫原性。本研究探讨了将高度保守的核蛋白肽（NP55-69 和 NP147-158）作为 CD4+ 和 CD8+ T 细胞抗原，与血凝素茎（HrHA）和基质蛋白 2 外域（4M2e）结合，在自组装蛋白质纳米笼（SAPNs）上定位抗原的分子设计及其能力。SAPNs 在其外部表面展示 HrHA 和 4M2e，同时将 NP 抗原嵌入内部。这种工程化的 SAPNs 具有模块化设计，通过优化的连接长度实现了精确的抗原定位和更高的可及性。这种纳米结构在小鼠体内引发了强烈的细胞和体液免疫反应，包括交叉反应性抗体和抗原特异性 T 细胞激活。这些发现突显了 SAPNs 作为通用流感疫苗开发的多功能平台的潜力，以及蛋白质设计在自组装蛋白质材料的空间组织中的作用及其对生物医学功能的影响。
引言
蛋白质纳米笼作为一种有效的疫苗平台，因为它们能够在保持天然抗原结构的同时整合多种抗原。[1],[2],[3],[4],[5],[6] 化学和生物偶联以及颗粒合成的显著进步进一步提高了蛋白质纳米颗粒在预防性免疫中的性能[7],[8],[9]。由于它们能够向免疫细胞呈现多价抗原阵列并触发针对传染性疾病的免疫反应，自组装蛋白质纳米颗粒已进展到临床试验阶段。例如，展示保守 HA 茎的自组装铁蛋白纳米颗粒已进入一期试验（NCT05155319 和 NCT03814720），而含有寡聚化核蛋白的重组蛋白质疫苗 OVX836 则处于二期试验（NCT05569239）。此外，类似病毒的蛋白质纳米颗粒（不含遗传物质）也显示出对流感的显著保护作用。值得注意的是，展示 HA 抗原的四价类似病毒颗粒在三期临床试验中表现出显著的效果（NCT03301051 和 NCT03739112）。[10] 此外，自组装蛋白质纳米笼的计算设计促进了从头设计疫苗纳米颗粒的发展[11],[12],[13],[14]。
尽管取得了这些进展，在设计和开发能够针对异质性流感病毒提供完全保护的疫苗纳米颗粒方面仍存在挑战。流感病毒具有动物源性并且突变迅速，这使得疫苗开发变得困难[15]。血凝素（HA）构成了流感病毒表面的大部分，并且具有高频率的季节性突变[15]。虽然 HA 的头部区域不断突变，但茎部相对保守[16],[17]，这为疫苗接种提供了机会。目前的流感疫苗纳米颗粒策略包括呈现高度保守但免疫原性较低的流感抗原域，以诱导足够强的交叉反应性免疫反应[18],[19],[20],[21],[22]。通常使用佐剂来实现这一目标，并提高亚单位疫苗纳米颗粒的效力[19],[20],[21],[23]。然而，必须仔细评估其应用以确保安全性。使用不同疫苗纳米颗粒平台的异源序贯免疫也被探索为提高交叉反应性免疫反应的策略[24]。具体来说，肌肉注射 mRNA 脂质纳米颗粒和鼻内注射蛋白质纳米颗粒的组合已被证明可以调节 Th1 和 Th2 抗体偏置，并影响免疫优势层次，从而增强交叉反应性免疫。利用 I53 纳米笼的镶嵌纳米颗粒免疫原，同时展示来自多种菌株的异亚型 HA，已成为扩大针对流感免疫反应的有希望的方法[1]。通过利用亲和力优先结合交叉反应性 B 细胞，这种策略将免疫焦点从可变的 HA 头部转移到保守的 HA 茎部。尽管在猕猴中观察到了针对茎部的强抗体反应，即使在针对免疫优势 HA 头部的强烈预先存在免疫的情况下也是如此，但完全避免抗 HA 头部的反应仍然具有挑战性。这个问题可以通过使用 PEG 化或糖基化来掩盖免疫优势位点来解决[25],[26],[27]。然而，多项研究表明，虽然这种方法不会影响针对未掩盖抗原的抗体的绝对水平，但它确实增加了这些抗体的比例，这引发了关于其在体液免疫反应中益处的疑问[28],[29],[30],[31]。另一种方法是将 HA 茎部展示在多价纳米颗粒上。然而，如铁蛋白[32],[33]或 I53 纳米笼[30]等纳米颗粒观察到的支架特异性免疫反应可能会干扰弱免疫原性抗原的特异性免疫反应。为了最小化非特异性免疫激活并增强针对弱免疫原性抗原的免疫，选择性地将保守抗原整合到本身不引发免疫反应的支架上可能是有益的。
之前，我们开发了自组装蛋白质纳米笼（SAPNs），但未检测到针对支架的任何免疫反应，因此将其作为通用流感疫苗进行应用[34]。两组卷曲螺旋肽驱动 SAPNs 的自组装[35],[36]，tGCN4 是 GCN4pII 的截短版本[37]，它是三聚体卷曲螺旋构建块，并与异二聚体卷曲螺旋对 tZE 或 tZR 形成二硫键，tZE 和 tZR 分别是 ZE 和 ZR 亮氨酸拉链的截短形式[39]。tZE 和 tZR 之间的高亲和力促进了笼子的组装。之前的 SAPN 设计使用了去除头部的 HA 茎部（HrHA），并将其与 tGCN4 基因融合以保持三聚体 HA 的构象，从而引发了针对不同 HA 亚型的广泛交叉反应性体液免疫反应[34]。此外，来自人类、禽类、鸟类和猪病毒的基质蛋白 2 外域嵌合肽（4M2e）也被基因融合到 tZE 上，并展示在笼子的内部表面。虽然 T 细胞反应在交叉反应性预防活性中起着重要作用[40],[41],[42],[43]，但在用 HrHA/4M2e SAPNs 免疫的小鼠中并未观察到显著的抗 M2e 和抗 HA 细胞免疫反应[34]。先前的研究表明，针对流感感染的交叉反应性保护与广泛的 T 细胞反应密切相关，独立于中和性体液免疫[44]。因此，将强且高度保守的 T 细胞表位整合到疫苗配方中可以显著增强通用流感疫苗的效力。
在这项工作中，我们通过将高度保守的核蛋白肽（NP55-69 和 NP147-158）作为 CD4+ 和 CD8+ T 细胞抗原，分别整合到笼子内部并与 tZR 融合，同时将 4M2e 抗原移动到与 tZE 融合的外部表面，重新设计了 SAPN 疫苗的成分[45],[46],[47],[48],[49]。这种设计保持了 SAPNs 外表面 HrHA 的高三聚体价态，从而诱导了针对流感的强抗 NP 细胞和交叉反应性抗 HrHA 体液免疫。有趣的是，在用新 SAPN 设计免疫的小鼠中观察到了显著改善的 M2e 特异性 T 细胞反应，但未观察到抗 M2e 体液免疫。鉴于重组蛋白质设计的便利性，通过较长的连接子将 4M2e 从 tZE 扩展到 SAPNs 的外部表面，以诱导抗 M2e 抗体。因此，通过应用分子设计来控制抗原的空间呈现，HrHA/4M2e/NP SAPNs 显著增强了针对流感抗原的体液和细胞免疫反应。
HrHA/4M2e/NP SAPNs 的合成与表征
SAPNs 通过使用 tGCN4、tZE 和 tZR 重组融合抗原，在外部用 HrHA（A/Puerto Rico/8/1934）和 4M2e 进行功能化，并在内部用三个串联的 NP55-69 和 NP147-158（NP55-NP147）进行功能化（图 1a）。选择这三个拷贝是基于先前显示强抗 NP 细胞反应的研究[58]。正如我们在之前的报告[34]中所展示的，HrHA 被基因融合到 tGCN4 的 N 末端（HrHA-tGCN4），以诱导 HrHA 的三聚化（图 1b）。为了将 4M2e 从
结论
在这项研究中，我们证明了通过整合新抗原、优化抗原定位以及调整抗原与纳米笼之间的连接长度，可以显著提高 SAPNs 作为通用流感疫苗的效力。这种纳米笼的合理设计使得抗原能够以可控的方向重复排列，在外部表面展示高度保守的三聚体 HA 茎部和 4M2e，同时将 NP T 细胞表位嵌入其中
重组蛋白的表达与纯化
4M2e-tZE、4M2e-XL-tZE 和 tZR-NP55-NP147 从 E.coli 中表达，并在纯化后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）替换缓冲液。简要来说，4M2e-tZE 和 tZR-NP55-NP147 被克隆到经过密码子优化的 pET17b 质粒中（GenScript）。蛋白质在 E.coli BL21 Star (DE3) 中表达，在 1 L Lysogeny Broth (LB) 培养基中，添加 100 μg/mL 的氨苄西林，培养温度为 37°C，转速为 120-130 rpm。通过添加最终浓度为 1 mM 的异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷来诱导蛋白质表达
CRediT 作者贡献声明
朴载英（Jaeyoung Park）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，研究，数据分析，概念化。玛丽埃拉·罗德里格斯-奥特罗（Mariela Rodriguez-Otero）：方法学，研究。朱莉·钱皮恩（Julie Champion）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，监督，项目管理，研究，资金获取，数据分析，概念化。西德尼·C·温伯利（Sydney C. Wimberley）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 –
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
这项工作得到了 M.T. Campagna 和 NIH NIAID（奖项编号：1R01AI183539-01A1）的财政支持。M.R.R.-O 得到了 国家科学研究生研究奖学金（编号：DGE-2039655）的支持。我们感谢乔治亚理工学院动物资源系的 Richard Noel 博士在动物研究方面的建议，以及 Nitasha Hairston 在动物工作方面的协助。我们还要感谢乔治亚理工学院纳米结构表征中心的 Yolande Berta
